工频磁场对人绒毛滋养细胞凋亡相关基因表达的影响

.论著.工频磁场对人绒毛滋养细胞凋亡相关基因表达的影响谭秋孙文均潘永苗孙忠兰胡根林姜槐.【摘要】目的研究50Hz工频磁场对人早孕绒毛滋养细胞凋亡相关搭频盖场对人生殖健康影响的可能机制方法体外分离培养人早孕绒毛滋养£度的正弦磁场分别辐照处理

6.

48.72h同时设立相应的平行对照组，用实时荧_链反应RT-PCR方法检测工频磁场辐照对bcl・

2、bax、caspase・3p53g基因表达的影响堵果辐照

6、

48、72h后bcl.

2、bax、c“pg.

3、p

53、fas基因表达变化倍数平均值均接近

1.暴露组与对照组的差异均没有统计学意义P

0.05o结论72h内

0.4mT工频褛场体外辐照不会影响人早孕绒毛滋养细胞bc】・

2、hax、caapafie.

3、p

53、fa6等凋亡相关基因的表达水平[关键词】工烦磁场I滋养细胞；凋亡；基因表达Apoptosis-relatedgeneexpressionofhumanviUoustrophoblastsexposedtoSOHzmagneticfieldTANQiu.SUNWen-jun^PANYimg・miw5UNHui.如HUGen-linJIANG・BioekciromagneuctLaborakhryZhejiangUniceniiyHangzhou310058ChinaCorrespondingAuthor^SUNWen-junE-nunl:sunwjzju.educn[Abstract]ObjectiveToatudyapoptosi^relatedgeneexpreaaionofhurnunvilloustrophoblastsexposedto50Hzmagneticfieldandtoinvestigatethepossiblemechanismofhumanreproductivehealtheffectscausedby50Hzmagneticfield.MethodsCulturedhumanvillouBtrophoblastswereexposedto50Hzmagneticfielda!

0.4mTfor64872hours.GeneexpressionsofBcl-2BaxCasptfse・3p53andFaswereanalyzedusingreal-timereversetranscriptionpolymereschainreactionRT-PCRaasay.ResultsWithin72hourstheaveragefoldchangeforeachgenewasnearL

00.andtherewasnosignificantdifferenceonexpressionpatternineachgenebetweenexposureandconlrolgroupsP

0.

05.Conduskm

0.4mT50Hzmagneticfielddoe®notaffecttheapoptosis-relatedgeneexprwwionofhumanvilloustiuphoblastsinvitro.[Keywords50Hzmagneticfield;Trophoblasts;Apoptosis;Geneexpression随着电力的广泛应用，环境中工频磁场的强度日益增高，由工频磁场暴*而产生的不良健康效应引起人们越来越多的关注已有报道母亲孕期暴露于工频磁场可引起自然流产等不良妊娠结局叫然而机制不明胎盘是母胎接触的界面，其功能正常与否直接影响到胎儿的生长发育c滋养细胞是胎盘绒毛的主要组成及功能细胞，相关研究表明，包括药物在内的许多外界有害因素可通过影响胎盘滋养细胞分泌、诱导滋养细胞过度凋亡等方式破坏胎盘功能，从而导致不良妊娠结局「气因此，对胎盘滋养细胞功能的研究已成为目前研究自然流产等不良效应机制的热点在前期的研究中发现工频磁场基金项A国家自依科学基金项目3CM70428；浙江省科技厅项B2006E10024作者单位.310058«州.浙江大学医学院生物电磋学承点实验室谭秋、孙文均、胡根林、姜愧】浙江大学医学院附N妇产科医院潘永苗、弥惠兰通讯作者:孙文均如nml:Aunwj^zjuzdu.en暴露可抑制滋养细胞的分泌功能，我们进一步研究工频磁场对滋养细胞凋亡相关基因bcl.

2、bax、caspa野・

3、p

53、fas表达的影响，以探索工频磁场暴露与绒毛滋养细胞凋亡的相关性，揭示工频磁场抑制滋养细胞分泌功能的可能机制材料与方法L研究对象:早孕绒毛来自浙江大学附属妇产科医院计划生育门诊自愿要求行人工流产的正常妊娠妇女，妊娠时间为8-10周，无腹痛或阴道流血等先兆流产症状，无服用流产药物史，无急慢性器质性或感染性病变，无有害理化因素接触史，既往无自然流产、出生儿缺陷史及家族性遗传疾病史2-绒毛处理:无菌条件下获取的新鲜胎盘绒毛组织保存在含抗生素的高糖DMEM培养液中，于术后半小时内送至实验室在无菌超净台内用含抗生索的D4Ianks液彻底冲洗，去除血污，用锻子及眼科乾仔细分离去除蜕膜、血管等组织，将绒毛组织剪碎成

0.5~L0mnf的小块将每孔约KOmg绒毛组织接种到细胞培葬板中，每孔加入含15%胎牛血清和1%抗生素（100U/ml青毒素、100头g/ml链霉素）的DMEM培养液1ml随机分为实验组（辐照组）和平行对照组，放入37弋、含5%CO2培养箱中平衡6h后，实验组移入辐照系统中于此后的第

6.

48.72h分别取两组中各一孔，冻存于液氮中备用辐照系统:该系统主要由一对Helmholtz线圈一只补偿线圈，两只调乐器及细胞培养箱构成其中，三只线圈相互串联后叠放于细胞培养箱中的铁制屏蔽箱内，线圈的两个端线与培养箱外的调压器相连当输入50Hz的交变电流后，三只线圈内的空间区域即构成了一个恒温、均匀、强度于0-

0.8mT之间连续可调的50Ik正弦磁场辐照区磁场强度由EFA-2电磁场分析仪（德国WandelGoltennann公司）直接测最本实验采用

0.4mT工浓度分别为:bcl-

20.15pmol/L；bax

0.20jimol/L;caspase-

30.20^unol/L;p

530.25；fasQ25呻ol/U在ABI7500定量PCR仪（美国AB1）上进行PCR反应，反应程序为95笔预变性10min95V变性15s、59幻退火10$、72幻延伸408进行40个个复孔的精照组孔以构厢组设空白对照组（即Oh组）基因表达的变化倍数为1各辐照组各基因变化倍数用SPSS

13.0软件进行onewayANOVA分析，用Dunnettt法进行实验组各时间亚组和空白对照组的两两比较频磁场持续辐照

6.

48.72ho总RNA提取:用Tri2ol（Invitrogen公司）提取绒毛组织总RNA用紫外分光光度仪测定浓度，以A260mn/A280mn判定纯度，并取少量进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量引物设计:用primer

5.0和oligo

6.0软件设计目标基因及内参基因引物，序列见表1引物均由上海生工生物制品有限公司合成凋亡相关基因及内参基因引物序列

6.荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT・PCR）各组均取总RNA

2.0四，以oligo（dT18）为引物，采一链，产物存于-20Y冰箱备用PCR反应体积为20皿，其中含1jdcDNAJO以含荧光染料SYBRGreenI的预混试剂（美国ABI）各基因上下游引物LRNA质量控制:提取的总RNA经紫外分光光度仪测定在1农

2.0之间甲醛变性凝胶电泳检测28S、18S条带清晰28S和18S亮度比值约为2山表明所提取RNA的质量好无降解.见图16h曲h72h28SSIRNA甲酸变性胶电泳图

2.工频磁场对凋亡相关基因表达的影响:溶解曲线分析结果提示5个目标基因和内参基因的PCR扩增产物的特异性好，无非特异性产物实验结果表明6h、48h、72h各时点bcl-

2.bax.caspase-

3、p

53、fas基因表达变化倍数平均值均接近1见图2-7；统计结果显示磁场辐照组和空白对照组相比无显著性差异（*

0.05仃8）见表20表2工频磁场对凋亡相关基因表达的影响任如）

2.0i.

51.

00.506b48h■露时间72h«隹手制V一■■图2磁场辐照对bcl.2表达的影响图3磁场辐照对bax表达的影响

2.0r正常虹双叫避1寸旧秋丁可怦娘盗，土安是滋养组织和蜕膜组织的正常功能胎盘的生长发育是一个动态过程，通过滋养细胞和蜕膜细胞的增殖与凋亡，不断进行组织结构的改建，以适应不同妊娠时期的要求实现其功能的完善在妊娠早期胎盘组织的滋养细胞凋亡较少，有利于维持胎盘屏障的完整性外界不良因素可通过诱导滋养细胞的过度凋亡•直接影响胎盘屏障的完整性以及减少人绒毛促

1.505LO.«率普6li48h72h彖31时间图4豪场辐照对bcl・2/bax表达的影响«空手愀性腺激素HCG和黄体酮等激素的分泌，导致流产等生殖健康毒效应的产生这是外界因素致流产的主要机制之一在前期研究中，我们发现

0.4mT工频磁场辐照体外培养的原代滋养细胞可毋显著抑制HCC与黄体酮分泌水平然而，工频磁场抑制滋养细胞分泌是由于其分泌功能下降及/或凋亡增加所致尚不清楚虽然细胞凋亡的过程复杂检测细胞凋亡的方法很多，然而细胞凋亡的分子生物学研究认为大部分细胞凋亡受相关基因的调控，因此检细胞凋亡相关基因的表达是检测细胞凋亡常用的方法之一已有相关的研究表明，滋养细胞凋亡往往与bcl・

2、bax、caspase，

3、p

53、fad等基因的异常表达密切相关目前，多数研究认为Bcl・2/Bax的比值决定细图6磴场辐照对p53表达的佗响«华芝制胞对于凋亡的易感性Bcl・2有抑制细胞凋亡的作用Bax有促进细胞凋亡的作用，二者通过形成二聚体发挥调控细胞凋亡的作用如果Bcl-2与Bax形成异二聚体，则阻抑细胞凋亡;如果Bax/Bax同二聚体增多，则促进细胞凋亡乳Lea等报道，妊娠3个月内的流产患者Bcl-2/Bax的比例和合体滋养细胞凋亡均较对照组升高，他认为Bcl・2家族产生相互作用并且形成抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白如Bd.2和Bax的二聚体，它们的比例决定了细胞的凋亡或存活叫Caspase是一个含有半胱氨酸活性的胞浆蛋白酶家族，各种凋亡诱导因素最终都通过Caspase蛋白系统起作用，其中Caspase-3蛋白的表达是各种细胞凋亡途径的最后关键步骤Caspa$e.3又称YAMAZ/apopin/CPP32f是调节人类及哺乳动物细胞凋亡的关键酶1L-1转换酶Interleukin-1ConvertingEnzymeICE家族的主要成员，它不仅是一种效应Caspase且处于Caspase凋亡传导通路的下游，具有凋亡的终极效应其表达的高低可能与细胞的凋亡表型直接相关Uu等的研究发现凋亡增加的胎盘组织caspase-3表达显著增高叫有研究者认为caspase-3基因表达增高引起滋养细胞凋亡可能是引起自然流产的一个很重要的原因叫p53是一个肿瘤抑制基因，有许多报道表明它具有诱导细胞凋亡的作用野生型p53抑癌基因被认为下调细胞增殖.可能是通过下调bcl.2和上调bax的表达而实现此作用Halperin等报道p53基因在胎盘主要表达于细胞滋养层■它在未分化细胞中的表达调控着滋养层细胞的增殖;有滋养层疾病的胎盘.如完全性菊萄胎和不完全性葡萄胎的病例中p53基因翅表达，大量滋养层细胞发生凋亡叫有研究发现，由于妊高征等病因造成胎儿宫内生长迟缓的病例p53基因的表达明显上调，并主要定位于细胞滋养层，推测是由于P53介导的滋养层细胞凋亡增加，导致胎盘功能障碍％可见p53基因主要参与细胞滋养层细胞的凋亡和增殖的调控，且可能与多种妊娠相关疾病的发生有关FasApo.lCD95属于肿瘤坏死因子TNF大家族，是一种分子危为45kD、介导凋亡的跨膜精蛋白在Fas配体FasL及Fas抗体作用下，细胞表面的Fas分子相互交联，向细胞内传导死亡信号，引起细胞凋亡日前的研究广泛认为F睥/FasL系统在各种正常及病理细胞中是一种诱导凋亡的主要分子机制，近来也认为其与胎盘的凋亡诱导有关Huppertz将FasL的表达定位于胎盘的绒毛细胞滋养层Fas则定位于绒毛合体滋养层㈣表达Fas的滋养层细胞可能通过与表达FasL的细胞结合而发生凋亡乳基因转录是细胞响应外界因素刺激的终端反应，因此，从基因转录水平研究电磁场的生物学效应是揭示电磁场与生物系统相互作用过程和机制的常用方法本研究结果表明，经工频磁场不同时间暴露后，各基因表达水平与对照组相比并无显著性差异.提示

0.4mT工频磁场体外暴露72h内不会改变bd・

2、bax、ca§pa3e.

3、p

53、fas等凋亡相关基因的表达由于利用人胎盘绒毛原代细胞模型研究极低频磁场生殖健康效应的报道很少，难以直接比较本领域的相关研究显示97mT的50Hz工频磁场辐照，可通过上调bax和caspase-

3.下调bcl2诱导骨腺癌细胞凋亡叫Ding等报道60Hz、5mT磁场不促进HT小如咔海正任位8口“蛋白表达字报道

0.

01、

0.

1、1x4h、24h后，£细胞bcl・x、bax!异四虽然不同丁能会存在一定四走弁，然叮，歹孰怡天所丸珀米提示极低频磁场不影响细胞凋亡相关基因或蛋白的表达与本研究结果相一致有意义的是，芬兰Lopucki等用人胎盘母胎双灌注模型研究了50Hz工频磁场对胎盘的影响，结果发现2mT、5mT磁场不引起胎盘小叶

8.OH.dG升高，即不引起DNA氧化损伤［14］采用相同材料的研究结果也在一定程度上支持本研究的结果因此我们推测

0.4tnT的工频磁场可能不会促进绒毛滋养细胞的凋亡但是，细胞凋亡相关基因表达水平的改变不能完全反映细胞凋亡情况，还需要从细胞、蛋白等水平作进一步验证HCG是由合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素，其产生过程包括蛋白质和多糖的合成、结合、形成分泌颗粒、聚集以及分泌；黄体酮则是由滋养细胞以胆固醇为前体，通过侧链缩短而产生的笛体激素HCG和黄体酮的合成与分泌均经历了复杂的过程，受到多种因素的调控滋养细胞凋亡程度是影响分泌水平的重要因素，但不是唯一原因本研究提示工频磁场有可能通过调节凋亡外的其他途径影响其分泌水平具体机制有待进一步研究参考文献FcychtingM.Non-canoerEMFeffectsrdiiedtochildren.Bicelec-trotnagnctice2005Suppl7:S69-

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2002、

37224222.〔3]郭玉萍掩伸，裳瑞，自然流产病例的绒毛与蜕膜细胞增殖和细胞凋亡的研究第三军医大学学报20024:

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1636.LopuckiMSchroeroldI«DadakAetal.Lowdoeemagneticfieldsionotcau«eoxidativeDNAdamageinhumanplacentalcotyledonsinvitro-29一•病例报告•升华硫氯化氨基汞洗剂致汞中毒一例兰开凤汞制剂常在内服和外用药配方中使用，但常因配方不当或使用不合理而引起药源性汞中毒本院收洽1例因使用升华硫氛化氨基汞洗剂外擦时间过长和擦破皮肤而导致亚急性汞中毒现报告如下患者男48岁，因全身多处白瘢风2006年10月初用升华硫筑化氨基汞洗剂外擦多处白缀，每日2次，持续使用约2个月2006年12月11日擦破皮肤3h后下腹部皮肤红肿，剧痛，派血3d后开始出现双下肢脚颈、脚背、脚小腿水肿，当地医生给予利尿治疗，水肿减轻3Td后又出现水肿.同时伴有心悸，失眠，发病后1周在当地中医院治疗半月，未见好转于2007年1月25日来我院职业科就诊，入院查体:体温35心率88次/min呼吸22次/mint血压100/80mmHglmmHg=

0.133kP发育良营养中，神志清楚，全身浅表淋巴结未触及，皮肤就膜无黄染，面色稽苍白，水肿双肺未闻及干、湿性啰音;心律齐，未闻及杂音;腹软无压痛及反跳痛，肝脾肋下未触及，四肢活动自如;全身皮肤散在白瘫，双下肢水肿X血常规正常肝功能:丙钗酸转氨酶ALT、天冬氛酸转敏醉AST正常乙肝表面抗原・总蛋白44g/L白蛋白25g/L肾功能:尿素氮

7.12mmol/L尿酸

0.268mmol/L.肌醉

80.20以mol/L血脂总胆固薛

9.60mmol/L甘油三酯

4.37nunol/L高密度脂逝白

2.29mmol/L低密度脂蛋白

6.43mmol/L尿常规:潜血⑴，皆白I++.胆红素-镜检:红细胞0-l/h0尿微量白蛋白100mg/L正常参考值＜20mg/L尿汞

0.59pmol/L正常参考值＜作者单位400060重庆市职业病防治院职业科

0.05junol/LB超:肝脾未见异常，肾脏右肾较小左肾较大，左肾集合系统异常回声入院诊断:1亚急性汞中毒;2中毒性肾病;3曾病综合征嘱卧床休息，低盐、低脂、优质蛋白质饮食，给予利尿，驱汞保肾，对症支持治疗在密切观察肾功能、尿量情况下，用二蔬丙横钠

0.125g半量用药肌肉注射，隔日一次驱汞治疗尿汞从

5.29pmol/L下降为

0.147呻1/L血清息蛋白49g/L白蛋白27g/L尿潜血-尿蛋白+1半月后，患者面部水肿消退，双下肢水肿逐渐减退，于2月16日自动出院2007年3月1B再次入院继续治疗，总蚩白上升为56g/L白蛋白升为32g/L尿汞下降到正常范围内，尿蛋白下降为1患者于两周后自动出院回家继续吃药治疗2007年4月11日门诊随访总蚩白56g/L白蛋白37g/L尿蛋白i仍然继续吃药治疗讨论升华硫氯化氨基汞洗剂主要成分为氯化氨基汞分子量为

252.07长期外用汞可经皮肤慢性吸收，并导致肾脏和中枢神经系统损害如果在使用时擦破皮肤.可使亲吸收量增加并引起汞中毒本例出现大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、同时伴有高脂血症，尿汞增高符合汞中毒所致肾病综合征通过治疗.尿汞虽然F降到正常范围，尿蛋白仍然2个加号，这说明肾损害程度校大恢复有一定难度因汞进入体内后以宵脏中含量较多，可占体内总汞最的70%~80%汞对肾脏损害，以近曲小管上皮细胞为主汞还引起免疫功能紊乱，产生自身抗体并发生肾病综合征或肾小球肾炎收稿日期2007418本文编辑:王伟循环八kQa»rr—个孔.并设】个lo

7.结勺参基因，实验9:，辐照组与平布rAACt表示，用，为3基园名称引物序列（5，・3‘）产物长度bd-2ACTTCGGTCGGCTCATGTGTGCACAAATCAAACAGAGGC166bpimTTGCrrCAGGCnTCATCCACTCGCTCAGdTCTTG92bp血AGGACATGCCTTAGAACTGnGGTCTTGCTGCTGAGT147hpp53gtaccaccatccactacaacAAACACGCACCTCAAAGC120bpCAGAGGCCATCGTTCTAGAACCAGGTGCTCTGCAGTAT159bpP-actinCTCGCTATGGAATCITGCGTTGGCCTACAGCTCHT92bp基因6h48h72hbd・2l.3O±O.

391.l6±

0.2l

1.32±

0.46baxlJthO.31l.）0±

0.

491.00±

0.36bcl-2/bax136±

0.50L40±

0.

511.20±

03012310281.17±

0.

231.

2010.29p531J11O.

231.21±

0.

171.07±

0.40fas

1.3O4OL

1910.

241.27±

0.38。