植物组织培养过程中克服基因型障碍的方法.pdf

维普殳讯h«p://www.cqvip.comdVol.11No.SOct.1993植物组织培养过程中克服基因型障碍的方法号有兰《北京市枪翎iffi胞工程实贬案100081植物生物技术是-•项高、新技术，其研究内容随着时代的发履也愈来愈丰富•从组织培养、细胞培奔，体细胞杂交等一直到DNA重组、基因转化和转基因植物的创造和应用近几年来•末谷类作物的生物技术有了较大的突破譬如小麦原生质体培养再生成苗•抗虫基因导入水稻赋与植株抗虫特性这些实例证明了植物生物技术必将会对下一个世纪的农业生产产生深刻的影响.所以我们应该对植物生物技术的研究和发展给子更多的关注.组织培养是植物生物技术研究的基础，如果离体的植物组织或细胞在人为控制的微环境条件下能够分化再生成完整的植株.这样的研究才最有意义.烟草的组织培养比较容易.所以它成为模式植物.研究得最为深入.原生质体培养和转基因植株的获得也都是用烟草作试验材料最先取得成功的从理论上讲.植物的组织和细胞具有全能性totipotency即每一个细胞都能在离体条件下培养成为一个新的个体.事实并非如此.实际上有不少种植物或同一种植物中不同的基因型，它们对组织培养的反应很差.很难在离体培养过程中顺利表达其全能性.实现植株的再生.通常我们把组织培养反应差的材料称之为顽拗性recalcitrate.迄今对某些植物或某些植物的基因型顽拗性的原因并不清井.内在的原因可能是受到基因调控的影响细胞雎以脱分化和再分化或者是内源激素的状态不平衡为细胞分裂设下了障一28_碍；外在的原因可能是对离体培养的微环境有特殊的要求，如营养物质光照、温度以及特殊的激素等.我们对这些特殊的要求不清楚未能予以满足.所以细胞也难以分裂生长・顽拗性使试脸材料的广泛利用受到了限制，在一定程度上影响了植物生物技术的研究和应用是从事这项研究的科技工作者认为最棘手的一个问题.目前还没有找到克服顽拗性的有效措施只是在试验过程中辅以各种方法，来提高组织培养的效果，降低顽拗性的影响有些方法取得了比较满意的效果，可陟参考.笔者根据近两年来“AgrkellRjport”中介绍的有关材料，对当前在植物组织培养过程中克服基因型障碍的方法作一综述以飨读者.微生物方法微生物与植物的相互关系是非常奥妙的有些微生物在生长过程中会分泌出一些对植物生长•有刺激作用的物质.有些微生物还会直接在植物细胞中生存，构成互利的关系.在植物组织培养过程中.利用与微生物共培养的方法，使植物组织或细胞与微生物一起组成一个有利的微生态环境，可以起到改善蛆织培养的效果.J.L.Ibave进行胡萝卜的细胞培养时，接入红球菌｛Rhadocacus｝与之共培养，结果细胞分化原率提高、形成的茎、根数量明显增加，叶片中叶绿素含量也有所提高.即使用培养红球菌的上清液加进培养基中也有较明显的效果.从共培养的培养基中分析出有异戊烯腺苛类的激素T.Matsunage用聚球藻Synechococcus、与胡萝卜的细胞共培养，能明显增加眨性细胞提高再生侬率H.Wake用念珠藻Nostoe鱼脱藻Anabaena异环藻.Xeno-coccus和聚球藻的热水提取物来堵养胡萝卜的悬浮细胞，都能使再生原率大大提高.聚球藻的热水提取物还能使培养了6年的蛇床Cnidturnofficinale的非胚性愈伤组织分化形成了胚Yang在研究大豆的组织培养时•把难以分化的茎、叶外植体与假单胞菌P$e・domonas共培养.结果形成了结节状愈伤组织，再生成绿苗，而且再生频率相当高.J・J.Germida在小麦根培养物中接入假单胞菌，也促使根和根毛的数量大大增加A.Smigocki用农杆菌Agrobacteriumtumefaciens｝与桃和苹果的愈伤组织进行共培养，即使培养基中不加激素，愈伤组织也能分化再生成小植株.经检测证明，农杆菌所特有的合成激素的基因在再生檀株中得以表达，说明在共培养过程中.农杆菌能进入愈伤组织，并导入了合成激索的基因.物理方法利用光、热、电、磁等物理因素对植物外植体直接产生刺激效应，可能会对细胞的分裂生长产生影响.收到良好的效果，但机理并不清楚.光照光的强度和质量对组织培养的影响是很明显的.A.Figueira在进行可可试管苗快繁时用强光C200Mmol/m2-sJ配合高浓度的CO220000ppm可以在不加蔗德的条件下使一些顽拗型的可可品种也能实现快繁.用山月桂作试验，也获得同样效果L.Urban用马铃薯进行块茎组织培养时，用强光500W/n培养的再生芽数量比对照200W/m2要增加2〜3倍A.K.Hvoslef-Eide试验证明红光和返、红外光有利于木本植物桦木和草木植物秋海窠愈伤组织和悬浮细胞的生长.RP-Hangarter把紫外光滤除的光线用于培养的番茄、胡萝卜的愈伤组织，取得较对照好的效果，意伤组织再生频率有明显的提高.温度低温或高温预处理组织培养的材料，提高培养效果.巨有很多实例，并巳得到广泛的应用但温度能激活细胞的原因并不清楚.Chen在进行水稻原生质体培养时，把已解高了的原生质体用45C处理8分钟，再置于冰浴中处理10秒钟，结果原生质体植板率比对照增加L8倍.从处理过的水稻原生质体中测定出7神热激蛋白.温度处理比较简单易行，可结合具体情况，进行试验，拢到适霞的方法.，

3.电、疏、股光和射线’，iP.K.Chand用弱电流2尸A、长时间J2周处理一些茄科植物的愈伤组织和原虫质体，获得了满意的效果，这些植物的分化强率都大大提高了.他又用强电流250〜750字，短时间10-30ps处理同样的材料，得群了同样的效果」，*，M.Lucchesini用樱桃作材料进行组絮培养时，把外植体置于电磁场之间，通电产生磁场.在磁场中处理l•定时间，可以有效地促进茎、根的生长，再生苗的数量多、长势旺.•AL—Juboory用XeCI激光处理石柑子、常春藤.时间25-30秒，可以大大提高再生象率:，•.、*Young用30Gy的1射线照射小妻祐药，出愈率可达到30%.而同材料未经蕙射的才只有3%DJ.Luckett用1〜5Gy的丫射线照射小麦花药，结果染色体加倍率、胚性愈伤组织和绿苗.数量都明显增加.4•气体在原生质体培养过程中用高浓度的纯机通进培养容器中有意想不到的效果.F.B.dctm用洁净消毒过的纯氧试验番茄、黄麻和水稻原生质体的生长速度和再生频率都比对照大大提高了..

5.其他J.Mather在进行蛇床的细胞培养时在培养基上加一层矿油，细胞在矿油层下分裂.结果趋向于胚胎发育途径，使胚的数量比对照增加了4倍.在这种微环境条件下形成了细胞渗透压与气体交换之间的复杂关系，但为什么能增加胚性细胞原因尚不清楚.•采用简单的干燥方法.也能对外植体的分化起到调投作用.M.Tsukahara把水稻的愈伤组织置于干滤纸上•密封24小时其含水量减少了50%.再把干燥的愈伤组织接入分化培养基再生频率高达47%.明显超过了对照M.P.Carron把橡胶的外植体先在干燥气流中处理5〜10分钟，再接种到较西水势的培养基上-

0.7mPa培养皿保持饱和的相对湿度结果也促进了大最体细胞胚的发生.N.Kaimori把胡萝卜、鸭儿芹的愈伤组织先在27C条件下干燥6个小时，再在干煤的皿中密封17个小时.然后再接到分化培养基上，能大量产生体细胞胚可能非胚性愈伤组织不耐干燥在干燥处理后大部分失活.旺性愈伤组织耐干燥，生活力也较强.-.化学方法用化学方法即在培养基中添加各种无机或有机的化学试剂.改变培养基的成分，来调控组织培养的进程.克服试材的顽拗性是比较行之有效的方法.有些试剂容易取得，效果也好，可以借签使用I但有些试剂国内可能不易搞到，这些方法只能供参考

1.改变碳源—30—配制组织培养用的培养基一般都以蔗糖作为细胞营养的碳素来源改变碳源可以提商组织培养的效果已有许多成功的实例最近报道的有B.R.Orshinsky作春小麦花药培养时，用麦芽糖代替蔗精，绿苗分化率大大提高G.Wenzel在液体马铃磐培养基中加水溶性聚^WFicoU100g/l和0/2M的麦芽精，结果

2430.枚春小麦的花药诱导分化出159棵绿苗.S.Millam用亚麻作组织培养，也发现麦芽糖对诱导茎的•形成效果优于蔗糖.

2.添加就氧化剂抗氧化刑可以消除组织培养过程中培养基中生成的自由募抑制次生过氧化物对细胞的危害促进细胞的分化常用的抗氧化剂有维生素C、草酸、p胡萝卜素、柠檬酸，对一般植物的组织培养都有一定的促进作用.A.Standard!在研究苹果组织培养时用聚乙烯毗咯烷酮Polyvinylpyrrolidone可明.显促进再生苗的生长卯生根.二・、添加撒;*无*B.Gaoii^-Sogo用甜瓜和西瓜的下5E轴和叶片作外械体进行离体培养.当培养基中加入硫酸钢皿」=§哈/1不仅提高了出愈率，再生芽的数量也明显增多.L.Purnhaus-er用

2.5mg/l硫酸钢，也发现对几种作物有促进再生的效果.小麦的再生频率比不加铜的培养基提高了2・3倍・.t4；添加乙埠抑制荆乙烯对组织培养有抑制作用.培养基中添加乙烯抑制剂能消除这种不良影响T.Gaspar用貌化钻、硫代硫酸银、氨基乙氧基乙烯基甘基酸aminoethoxyvinylglycine对马铃薯的蛆织培养有良好的效果.K.M.Chraibi用10〜2SM氯化钻，有利促进向日葵子叶和茎段的高体培养，产生校多的再生苗如果加入乙烯生成^tjEthephon就会不显示氯化钻的效果添加有机酸根据国外报道用有机酸来提高组织培养的效果较好•日益受到重视采用的有机酸种类:多•试验的植物范围也广•值得引起我们的重视.MRavnikar用1〜10pM的茉莉酸Jasmonicacid.可使菜豆外植体大剧:产生幼茎和根；而用于葡萄.只要・01〜l.OptM的浓度就能诱导芽的同步发生，而且芽长出的幼茎长度也超过对照A.M.Ming把茉莉酸用于马铃薯的组织培养•形成的幼薯氐多质好.R.S.Kobayashi用对氯苯酚异丁酸PC1B.Parachlorophenoxyisobutyricacid10^M可明显促进甘薯的幼茎再生.A.F.Tiburcio用

0.5mM的二氟甲基精氮酸DFMA・DL-a-difluoromethylargininc试脸于玉米幼胚培养.取得极好的效果.一些顽拗性基因型玉米材料也获再生，再生频率比对照提高4倍.而且再生植株生育整齐一致A.F.Tiburcio认为DFMA是克服顽拗性最有效的一种方法它是一种生物合成的多胺抑制剂，不仅对玉米而且对其他作物的组培研究都会有效.另外K.J.Kasha用苯醋酸PAAphenylaceticacid进行春小麦、大麦的花药培养.用域1〜100mg/l视不同的基因型而定结果是令人惊喜的春小麦接种100个花药可再生出绿苗322枚大麦接种100个花药再生出绿苗的数量超过了1000添加牝而活化剂V.Kumar在培养基中加入

0.1%非离于表面活化剂Pluronic-F

68.结果茄科植物在原生质体培养时植板率大大提高.愈伤组织形成的数量也明显增多添加抗生玄H.J.Newbury发现在培养基中添加玫节青霉素和青霉素对金鱼草的再生和根系生长都有利.在分析这种培养基时检狷出有较高生理活性水平的苯醋酸

8.添加其他物质据报道添加一些盐类、蕤基酸类、胺类等物质.也有极好的组织效果.这些物质起到可以代替激素的作用.可能被视为新的激素物质.D.A.Stuart分别用醋酸钾、苹果酸钾、丁二酸钾、酒石酸钾和草酸钾10〜70mM对苜蓿进行试验•结果可以促使芯胎发生的途径；体细胞胚的•数置增加，再生频率也明显提高.K.Shetty用硫脯甄酸fthioproline对一种剪股颍牧草进行组织培养时能使胚性冠伤玺织多达95%在不含激素的MS培养基上也能分化出绿苗H.E.Flores用多巴胺dopamine和去甲肾上腺素norepinephrine培养烟草细胞细胞鲜重比对照增加4〜6倍［培养Acinellaoppoutifolia.ft细胞的鲜重比对照增加一倍分析原因可能是这一类物质有防止WI噪乙酸氧化的作用，使培养基中始终保持较高的生长素水平R.D.Teasdale在松的细睥培养中.加入低聚^oligosaccharide.能大大增加细胞培养的密度J.F.Seclye只用

0.Olmg/l的Thidiazuron培养弥猴挑，其效果超过常用的激素6BA.J.Ponsamuel发成四苯硼TPBtetraphenylboron和苯硼酸PBOAphenylboronicacid比常用的24—D和NAA等有效只要用10心就能促进很多种植物外植体分化出幼茎和幼根.P.E.Read发现苯脉类化合物〈thidiazuron和CPPU的效果比玉米素强100倍.对板栗、玫瑰和耆石竹等多种植物的组织培养都起到极好的效果。