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灵苗胶囊对直结肠癌10V0细胞凋亡相关基因表达的影响来源时间2022-11-10灵芭胶囊源于传统医药方剂,经现代化的加工制成,方中灵芝等名贵中草药对于肿瘤的治疗具有一定的疗效通过前期研究,笔者发现,灵茂胶囊对于消化道肿瘤具有一定的抑制作用本课题选取直结肠癌细胞lovo细胞,进一步探讨灵茂胶囊对直结肠癌lovo细胞肿瘤凋亡相关基因表达的作用及机制1材料与方法
1.1细胞株人源性直结肠癌lovo细胞由黑龙江省肿瘤医院提供
1.2药物与试剂灵英胶囊,药物组成黄芭、灵芝、莪术、茯苓、人参、贯众、山药、枸杞子、重楼、山慈菇等该胶囊由本教研室自行制备,每颗胶囊约含生药量为L65g,于4冰箱存放备用,实验时配制成混悬液;5-氟尿嘴唳注射液天津金耀氨基酸有限公司提供,批号20220424,国药准字:H2022959;BSA哈尔滨赛拓科技有限公司;抗体Caspase3H-170sc-13-87Santa生物公司;二抗R bLgGH+l/FLTO中杉,哈尔滨赛拓科技有限公司;-actin上海翔升生物科技有限公司专业提供;显色液和蛋白Marker碧云天生物技术研究所提供;转膜液SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5自行配制;TBS缓冲液;TBST缓冲液;BSA封闭液;L5molL-lTrisHCLpH
8.8;
1.OmolL-lTrisHCLpH
6.8;
1.OmolL-lTrisHCLpH
7.5;质量分数30%丙烯酰胺;质量分数20%Tween20;质量分数10%SDS;质量分数10%过硫酸铁AP;G250考马斯亮蓝溶液蛋白定量专用;单去污剂裂解液PMSF;电泳液缓冲液;转膜缓冲液
1.3实验仪器蛋白质印迹法所用器材由黑龙江省肿瘤医院提供;电泳仪北京赛百奥科技有限公司;DYY-12及凝胶成像仪UVPUSA;紫外可见光分光光度计日本岛津公司;PVDF膜和滤纸选欧尔公司;离心管eppendorf公司
1.4实验方法
1.
4.1实验分组将Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,灵茂胶囊高剂量组予以灵茂胶囊
35.64gkgd—1灌胃,灵芭胶囊中剂量组予以灵茂胶囊
17.82gkgd—1灌胃,灵英胶囊低剂量组予以灵茂胶囊
8.91gkgd-1灌胃,阳性对照组予以5-氟尿咯哽注射液
0.027gkgd-1灌胃,空白对照组予以等体积生理盐水灌胃,给药7d后取血,分离血清,去除杂质,滤过灭菌,一4寸放置备用将不同组别的对数生长期的lovo细胞培养至细胞贴壁后,分别放入相应的含药血清,48h后收集细胞
1.
4.2提取蛋白
①收集细胞将不同组别的细胞用胰蛋白酶进行消化,用质量分数
0.996氯化钠注射液洗3遍,PBS4℃10min,转到EP管中,4000rmin—l离心5min离心半径8cm,倒弃上清液,重复洗涤3遍
②细胞裂解每管细胞加入裂解液200L,与细胞充分混匀温度4T,每间隔15min涡旋1次,使得细胞得以充分裂解,将裂解后的细胞离心12000rmin—l,4℃,离心半径8cm提取上清液备用
1.
4.3检测蛋白含量应用考马斯亮蓝法检测蛋白含量,计算蛋白的上样量
1.
4.4冻存变形的蛋白样本放置于61oddingbuffer中,99℃水浴中进行涡旋,约5min冷却后,冻存,长期存放于一80冰箱
1.
4.5蛋白质印迹法流程玻璃板洗净、晾干备用,放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶配制质量分数10%分离胶,需要以下材料质量分数10%分离胶7矶,去离子水
2.8mL,质量分数3096丙烯酰胺ACR
2.31mL,Trispll
8.
81.75mL,质量分数10%SDS70L,质量分数10%过硫酸铉AP70L加入TEMED3L后立即摇匀即可灌胶将滤纸及PVD膜泡在转膜液中论文发表《中国卫生产业》杂志投稿咨询1105665663更多文章可在云投稿查看上一篇文章tpoab和tgab滴度与graves甲亢手术治疗后甲减的关系下一篇文章ffh基因沉默对变形链球菌耐氟菌株耐酸性的影响。