还剩2页未读,继续阅读
文本内容:
实验29植物同工酶和可溶性蛋白质的凝胶电泳同工酶是指能催化同一种化学反应,但其分子结构不同的一组酶,它和其它种类的蛋白质一样,都是DNA编码的遗传信息表达的产物植物同工酶与植物的生长、发育阶段和环境条件密切相关不同的植物组织或器官由于其形态特征和化学组成各异,合成的蛋白质种类(包括酶蛋白)不同近期研究表明,植物在非正常生长环境或在其它逆境条件下,可以诱导植物合成新的特异性蛋白,同工酶谱也会发生改变因此,在研究植物基因表达调控与生长发育及环境条件的关系以及许多生理遗传问题时,常常要分析可溶性蛋白质和同工酶,这在理论和实践中都具有十分重要的意义用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可溶性蛋白质和同工酶方法简便,灵敏度高,重现性强,结果便于观察、记录和保存,为许多研究者广为采用【原理】带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动,叫做电泳若以V代表球形分子在电场中的移动速度,E代表电场强度,q为带电粒子所带电荷量,粒子半径为r,溶液粘度为n,则V二为彳6即为电泳速度与电场强度和颗粒所带电荷量成正比,而与颗粒的大小、溶液的粘度成反比在一定的pH条件下,每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状,在相同的电场经一定时间的电泳,便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带不同组分的蛋白质(包括同工酶)分子组成、结构、大小、形状均有所不同,在溶液中所带的电荷多寡不同,在电场中的运动速度也不同因此经过电泳便会分成不同的区带然后用适当的染料着色,这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis,缩写为PAGE)是以聚丙烯酰凝胶作支持介质的一种电泳方法它是由丙烯酰胺单体(Acrylamide简称Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(N•N-methylena Bisacrylamide简称Bis)在催化剂的作用下,聚合交联而成的三维网状结构凝胶当Acr和Bis遇到自由基时,便能聚合引发自由基产生的方法有两种化学法和光化学法,亦称为化学聚合或光化学聚合法化学聚合的引发剂是过硫酸胺(简称PA)在催化剂N,N,N,N-甲基乙二胺(Tetramethylenediamine简称TEMED)的作用下,由PA形成氧自由基而引发聚合反应,由于反应需要TEMED的游离碱基,所以在低pH下,聚合反应可能延迟甚至被阻止增加TEMED或过硫酸镂浓度可以增加聚合反应速度,但速度过快影响制板操作,两者浓度过高也影响蛋白质活性光聚合以核黄素(VB2)作为催化剂(可以不加TEMED),在痕量氧的存在下,光照起动核黄素光解形成自由基,从而引发聚合作用但过量的氧会阻止链长的增加若在光聚合时加入TEMED可以加速聚合光聚合形成的凝胶孔径较大,而且随时间延长逐渐变小,不太稳定,所以用它来制备大孔径凝胶较合适采用过硫酸钱-TEMED化学聚合形成的凝胶孔径较小,而且重复性好,常用来制备分离胶氧抑制聚合反应,因此凝胶混合物在聚合前需要脱气Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度,用T%表示凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度,用C%表示2100上X100T%=m;C%=a+b式中a一Acr的质量(g);b—Bis的质量(g);m—凝胶溶液总体积(ml)在此,a bW/W)是关键;a bW时,形成的凝胶脆、硬、呈乳白色;a b100时,即使5%的凝胶也呈糊状,易断裂要制备透明而有弹性的凝胶,ab要控制在30左右通常T=2%〜5%时,ab=20左右;T=5%〜10%时,ab=40左右;T=15%〜20%时,a:b=125〜200左右T在3%〜25%的范围内,凝胶易发生聚合T=
7.5%的胶称作标准凝胶大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离的效应有三个,一是电荷效应各种蛋白质分子所带电荷不同,在同一电场中泳动率不同;二是分子筛效应;蛋白质分子大小和形状各不相同,在通过一定浓度(一定孔径)凝胶时受阻力各不相同,泳动率也不相同;三是凝胶为不连续系统(凝胶层、pH、电位梯度均不连续),从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带,即所谓浓缩效应,提高了条带分辩率【仪器与用具】电泳仪一套(稳压电源,垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃);真空泵及真空干燥器;台式高速离心机(lOOOOrpm);烧杯50mlX125mlX1;三角瓶lOOmlX l;微量进样器50U1X2;注射器:5mlXl;穿刺针头;皮头滴管;刻度吸10mlX35ml义
2、O.lmlXl;医用胶布;培养皿20mlX2(或用白瓷盘代替,染色用)【试剂】30%丙烯酰胺(Acr,未纯化的试剂,配制后需过滤);1%甲叉双丙烯酰胺(Bis);10%的过硫酸钱(AP冰箱贮藏,不得超过5天);分离胶缓冲贮备液(3mol/LTris-HCl pH
8.8)称取
36.6gTris加30ml蒸储水和48ml Imol/LHC1,再用酸度计调pH至
8.8,定容至100ml;浓缩胶缓冲贮备液(
0.5mol/LTris-HCl pH
6.8)称取
6.0gTris溶于40ml蒸水中,用lmol/L HC1约48ml调至pH=
6.8,定容至100ml;电极缓冲液(
0.25mol/LTris,L92mol/L甘氨酸,pH
8.3)称取3gTris
14.4g甘氨酸,重蒸储水定容至100mL用时稀释10倍N,N,N,N-甲基乙二胺TEMED;提样缓冲液稀释4倍的浓缩胶缓冲液;样品处理液5ml甘油,
0.5ml
0.1%澳酚蓝,5ml浓缩胶缓冲液,加水
14.5ml;
1.5%琼脂【方法】
1.凝胶制备:夹条,按图29-1安装并用胶布将两侧封好将板用铁夹固定于制胶架上,下部插入封胶琼脂小盒中待模具安装好后,用电极缓冲液配制
1.5%琼脂液(冬天
1.5%,夏天2%),沸水浴加热至琼脂完全溶化后,用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔(图29-ld)再直接于琼脂盒(图29-lc)将琼脂灌入,注意不要产生气泡一旦用琼脂封板后,模具不应再挪动,以防产生裂缝封好的模具应三面有连续琼脂封闭区(图29-lb)o
(1)取两块电泳玻板(其中一块有凹槽),用热去污剂洗净,蒸馄水冲洗,直立干燥洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污根据所需凝胶厚度选择1图29-1Studi er型板胶电泳仪及制胶模具组装图〜3mm厚的玻璃或Teflon a.Studier型板胶电泳仪;b.已准备好的灌胶室[
6.样品室,架于两玻璃之间(灌胶前去掉)
7.已灌好的琼脂密封圈,呈凹形];c.准备封闭的胶室(
1.玻璃或Teflon夹条
2.封胶孔
5.封胶盒
7.琼脂从下部缝隙进入胶室下部,使胶室密封);d.胶室一侧横断面(
3.为胶布使夹条1玻板4和胶布之间形成封胶孔2)表29-1丙烯酰胺凝胶配制表类别分离胶浓缩胶T%
57.
51012.
51517.520330%Acr
5.
07.
39.
7512.
3214.
8817.
420.01l%Bis
45.
67.
55.
43.
53.531分离胶缓冲液
3.
753.
753.
753.
753.
753.
753.75浓缩胶缓冲液-------
2.5重蒸水
17.
0513.
158.
88.
337.
675.
153.
055.4310%AP
0.
20.
20.
20.
20.
20.
20.
20.07注分离胶30mL浓缩胶10mL可根据需要,按比例增减各成份的体积
(2)根据需要从表29-1中选择适当浓度值,配制凝胶一般同工酶可选择
7.5%〜10%的胶(过氧化物酶和酯酶
7.5%较合适,超氧化物岐化酶用10%,可溶性蛋白可根据需要配制)将配制好的凝胶液置真空干燥器中,抽气lOmin,再加入TEMED15U1,混匀后用一细玻棒引流,沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中,注胶过程防止气泡产生胶液加到离凹槽3cm处为止,立即用注射器轻轻在胶溶液上面铺1cm高的水层,但不要扰乱丙烯酰胺胶面待分离胶和水层之间出现清晰的界面时,表示聚合已完成用注射器小心吸出上层覆盖水,按上表配制好浓缩胶,抽气后加入5U1TEMED,混合后加到分离胶上层,插入预先选择好的样品梳,注意不要带入气泡
2.样品制备采小麦幼苗上数第一展开叶,取中部,除去叶脉,准确称取1g,加入少量提样缓冲液,置冰浴研磨匀浆后定容至5mL lOOOOrpm离心15min,上清液为可溶性蛋白和的粗提液取此液
0.5ml加入等体积样品处理液,混匀后贮于冰箱备用
(1)将制好的凝胶板夹在电泳槽上,向上下槽注入电极缓冲液,取下样品梳(注意不要拉断样槽隔墙)将微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样每槽点样15〜201H
(2)上槽接负极,下槽接正级,接通电源,电流调至15〜20mA,电压为200V,电泳至澳酚蓝标志到达凝胶前沿为止将电流、电压调至零后断电
(3)电泳结束后,取下玻板,揭掉胶布,抽出夹条,将两块玻板置自来水龙头下,借助水流,用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板(注意切忌从凹槽处撬),将胶放入染色液中
3.染色
(1)过氧化物酶染色称取
0.1g联苯胺,加少量无水乙醇溶解,依次加入5moi/LHAC10ml,
1.5mol/LNaAC10mL,H2O70ml,最后加入3〜5滴H2O2将此显色液倾入20cm培养皿中,待电泳凝胶片加入后不断搅动,观察各条带显色的先后,照像或用铅笔画出过氧化物酶同工酶谱最后用7%醋酸固定(注意色带在HAC溶液中容易褪色,固定时间不宜过长)拍照或制成干胶片保存结果
(2)酯酶同工酶显色称取50mg a-醋酸蔡酯,50mg B-醋酸蔡酯,100mg坚牢蓝RR(或坚牢蓝B),先用约5ml丙酮溶解,再用
0.1mol/L pH
5.0的磷酸缓冲液稀释到150mL将胶板浸入100ml此液中,室温下显色约20min,可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带弃去染色液,用蒸储水漂洗,再用7%HAC固定3超氧化物歧化酶染色染色液组成氮蓝四唾NBT25umol/L;核黄素
0.01%;50mmol/LpH
7.8磷酸缓冲液含Immol/LEDTA;染色时,将准备好的电泳胶板放入盛有80mlNBT溶液根据胶板大小加减溶液用量的培养皿中,浸泡15min后,换核黄素溶液浸泡5min;然后将胶板放入含有Immol/LEDTA的pH
7.8磷酸缓冲液中,在距胶板10cm高度用40W日光灯直射胶面,直至在蓝色背景上出现透明条带为止4过氧化氢酶同工酶染色染色液的组成A液3%H2O225ml,
0.1mol/L pH
7.0磷酸缓冲液5mL
0.1mol/L Na2S2O
33.5ml;B液
0.09mol/L KI25ml力口蒸储水25ml;先将准备好的电泳胶板浸泡在A液中,室温下放置15min,倒出A液,用蒸储水彻底冲洗干净,加入B液,酶活性表现在蓝色背景上的白色区带蒸储水漂洗后10%甘油固定5可溶性蛋白的染色称取
0.2g考马斯亮蓝R250,用少量无水乙醇溶解,用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀释至200mlo将胶板浸入此液室温下染色5〜6h,倒去染色液,用水冲洗附着于胶面的染料,再将胶浸入脱色液中400ml乙醇,70ml冰醋酸加水到1000ml更换脱色液几次,直到背景清晰为止6结果保存将脱过色的凝胶照像或扫描后作为实验报告的凭证作为学生实验报告可用绘图或制作干胶的方法记录酶谱带或可溶性蛋白质的主要谱带或用干胶片保存结果方法如下A.干胶制备裁下2张比胶片四边长3cm左右的玻璃纸在水中浸湿后,先将一张平铺在玻璃板上,放上凝胶片再盖上另一张,用玻棒赶走气泡,将玻璃纸边缘折向玻板底部,用另一块同样大小的玻璃板压住,再用夹子夹住两端固定,室温下避光放置一天左右即可,然后取下干胶,修剪整齐保存B.绘图表示将各种酶带按照颜色深浅绘成谱带图【附注】LSOD同工酶电泳时,分离胶浓度应选择10%;样品提取液可用50mmol/LpH
7.8的磷酸缓冲液比较理想
2.Acr和Bis是神经性毒剂,且对皮肤有刺激作用配制贮液、配胶、灌胶操作时,要戴上医用乳胶手套或指套,避免与皮肤接触只要细心操作,一般不会引起损伤
3.Acr和Bis的纯化精确的定量分析和制备电泳需要纯度更高的Acr和Bis,其提纯方法如下1Acr重结晶方法将Acr溶于50℃氯仿中70g/L,趁热过滤,滤液冷却至-20℃,结晶用冷的布氏漏斗抽滤,收集结晶用冷氯仿淋洗结晶,真空干燥纯Acr的熔点为
84.5±
0.3℃o2Bis重结晶方法将12g Bis溶于1000ml40〜50℃的丙酮中,趁热过滤,滤液逐渐冷却至20℃,用冷的布氏漏斗抽滤,收集结晶用冷丙酮淋洗,真空十燥纯Bis的熔点为185℃【思考题】
1.简述聚丙炜酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理同工酶定位原理是什么?
2.上下两槽电极液用过一次后能否混合后供下次电泳使用?为什么?
3.S0D和过氧化物酶同工酶的染色方法与其它3种染色法在原理上有何不同?。