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文本内容:
酵母RNA的提取紫外吸取法测RNA浓度实验报告
一、实验目的
1、掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法
2、掌握紫外线(UV)吸取法测定核酸浓度的原理“
3、熟悉紫外分光光度计的使用方法
二、实验原理核酸是生命的最基本物质之一广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内对核酸的研究是更进一步研究生命体的基本前提之一研究核酸需要纯度很高的核酸所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相称重要本次实验提取酵母的核糖核酸(RNA)oRNA离体后稳定性很差,含量低,所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性,防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌,特别重要的是防止RNA酶的作用本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法核酸(RNA)都是由核甘酸组成的多聚核甘酸化合物,而核甘酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的,故测定组成核甘酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量提取RNA的方法很多,在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法前者是运用碱使细菌细胞壁溶解是RNA释放出来后者是在加热的条件下,运用高浓度的盐改变细胞膜的通透性,使RNA释放出来使用浓盐法提取RNA的时候应当注意掌握温度,直接至90~100℃浸提避免在20~70℃的时间过长,由于这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围,会使RNA降解而减少提取率这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的一般方法但是这两种方法各有利弊,如浓盐法提取的RNA纯度高,而稀碱法提取的时间短,提取率高,更利于工业化生产RNA在260nm处有最大吸取峰,一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比,故可以用紫外分光光度计通过比色来测定RNA含量由于蛋白质在280nm波长处也有光吸取,对RNA测定有一定的干扰作用,但蛋白质的最大吸取峰在280nm处,如同时测定280nm的光吸取通过计算可消除其对RNA测定的影响因此如其中具有蛋白质时必须同时测定280nni和260nm的吸光度,可通过计算测定溶液中RNA的含量
三、实验器材电子天平、离心机、量筒、烧杯、锥形瓶、紫外分光光度计、容量瓶100mL、移液管5ml、试管和试管架、PH1-14试纸
四、实验试剂
0.2%NaOH、酸性乙醇5mlHCl加入剂、500ml95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、酵母粉、第一次实验所提取的酵母RNA、标准RNA液100ug/ml.O2%NaoH溶液、蒸镭水
五、实验环节
1、称取4g干酵母粉,放入200nli锥形瓶中,加入40nli
0.2%NaOH沸水浴30分钟后流水冷却将冷却后的液体倒入离心管中,离心15分钟4000转/min0留上清液,加入95%酸性乙醇溶液40ml边加边搅拌,再4000转/min离心5mino保存沉淀,用10ml95%乙醇洗沉淀两次,每次洗后离心3000转/min5分钟洗完后,再用10ml无水乙醇分别洗涤两次每次洗后离心5min3000转/mino最后,收集沉淀于滤纸上,保存备用
2、称取
0.2460gRNA于100ml烧杯中,加21nl
0.2%NaOH和lmlH2O溶解调成糊状,加入50m1左右水边溶解边用
0.2%NaOH调PH至
7.0后定容至100m1混匀
3、取2ml定容后溶液再定容至100m1按表
1.所示分别向试管中加入定量试剂混匀,用紫外分光光度计260nm紫外线测吸光度其并登记表格
4、反复环节
3.
5、再一次反复环节
3.表
2.根据表
1.表
2.绘制出标准曲线紫外线测RNA浓度标准曲线260nm吸光度样品平均吸光度为o.707通过标准曲线可得到稀释后样品浓度为
30.739ng/ml所得样品RNA百分含量3==
62.48%
七、分析与讨论
1、在使用离心机时离心管要对称放置,并且对称的离心管重量也要相同否则会对离心机导致毁坏
2、提取RNA最后在用酒精洗涤沉淀时要充足混匀,提高提取的RNA的浓度
3、根据理论在5-45ug/ml与吸光值成正比,而该范围的两个端点没有取到这样所得到的标准曲线的范围变小并且也许会有一定偏差,进而也许导致实验结果出现误差
4、用紫外光吸取法测定样品的核酸含量,具有简朴、快速、灵敏度高的优点,但是待测核酸样品中具有的微量蛋白质和核甘酸等吸取紫外光物质时会产生较小测定误差由于蛋白质在280nm波长处有光吸取假如同时测定280nm的光吸取通过计算可消除蛋白质对RNA测定的影响,减少实验误差
5、我们组得到的RNA的浓度相对来说是较高的,这得益于我们操作过程的更加准确与细心在测定吸光度时对没有用手碰触比色皿的光滑一面,保持实验的准确性前鼓号1234567平行1检平行326屣赧
00.
2390.
3520.
4680.
5820.
6890.
9080.
6980.
7250.697。