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实验名称碱性磷酸酹的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2023年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师署名批改日期碱性磷酸酶AKP或ALP是一种底物特异性较低在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶,需要镁和钵离子为激活剂AKP具有磷酸基团转移活性,能将底物中的磷酸基团转移到另一个具有羟基的接受体上,如磷酸基团的接受体是水,则其作用就是水解AKP最适PH范围为
8.6—10动物中AKP重要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上血清AKP重要来自肝,小部分来自骨骼AKP可从组织中分离纯化,也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体,转入宿主菌中进行重组表达,并从表达菌提取,并进行酶动力学分析一实验原理
1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似,常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化有时需要多种方法配合使用,才干得到高纯度的酶蛋白本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP正丁醇能使部分杂蛋白变性,过滤除去杂蛋白即为具有AKP的滤液AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中,而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中,通过离心即可得到初步纯化的AKPo
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定酶的比活性用每亳克蛋白质具有的酶活性来表达,单位U/mg・pr来表达因此,测定样品的比活性必须测定a每亳升样品中的蛋白质亳克数;b每毫升样品中的酶活性单位数酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高本实验以磷酸苯二钠为底物由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用,经铁氟化钾氧化,生成红色的醍衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比于510nm处比色即可求出反映过程中产生的酚含量,而碱性磷酸酶的活性单位可定义为:在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、PH和酶的浓度一定期,酶促反映速度与底物浓度之间的关系表现为反映开始时酶促反映的速度(V)随底物浓度(S)的增长而迅速增长若继续增长底物浓度反映速度的增长率将减少当底物浓度增长到某种限度时,反映速度就会达成一个极限值,即最大反引发速度(Vmax)底物浓度与酶促反映速度的这种关系可用米氏方程式表达:VM-x•[S]V=Km+[S]式中:Vmax为最大反映速度[S]为底物浓度;Km为米氏常数;V代表反映的起始速度
①当v=Vmax/2时,Km=[S]o因此,Km等于酶促反映速度达最大值一半时的底物浓度
②Km是陶的最重要的特性性常数,测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法大多数酶的Km值在
0.01-100mmo1/L
③Km和Vmax的测定:重要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法此式为直线方程,以不同的底物浓度1/S为横坐标,以1/V为纵坐标,并将各点连成一直线,向纵轴方向延长此线与横轴相交的负截距为-l/Km由此可以对的球的该酶的Km值方程式与图如下:本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同底物浓度时的酶活性再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸能催化水解,生成游离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用,经铁锐化钾氧化,生成红色的醍衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比根据吸光值得大小可以计算出能的活性也可以从标准曲线上差得酚的含量,进而算出酶活性的大小
二、实验材料
(一)碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定
1、样品兔肝
2、试剂
①
0.5mol/L乙酸镁溶液
②
0.1mol/L乙酸钠溶液
③
0.0Imol/L乙酸镁一
0.01mol/L乙酸钠溶液
④O.OlmoI/L丁一§一
0.01»101人乙酸镁「^
18.8缓冲液
⑤丙酮(分析纯)
⑥95%乙静(分析纯)
⑦正丁醇(分析纯)
⑧
0.04mol/L底物液
⑨分标准液⑩
0.5mol/LNaOH⑪
0.3%4-氨基安替比林⑫
0.5%铁鼠化钾⑬
0.Img/mL蛋白标准液⑭碱性铜试剂⑮酚试剂
3、仪器与器材
①研钵
②刻度离心管
③刻度吸管
④电动离心机
⑤玻璃漏斗和玻璃棒
⑥托盘天平
⑦恒温水浴
⑧可见分光光度计二底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
1、样品兔肝匀浆液
2、试剂
①
0.04moi/L底物液
②
0.1mol/L碳酸盐缓冲液PH1037C
③碱性溶液
④
0.5%铁^化钾
⑤
0.3%4-氨基安替比林©酚标准液(
0.1mg/ml)
3、仪器与器材
①恒温水浴锅
②可见光分光光度计
三、实验环节
(一)AKP的提取AKP提取实验环节
(二)AKP的比活性测定
1、AKP的活性测定AKP活性测定实验环节环节
2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验环节三底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
1、底物浓度对酶促反映速度的影响将新鲜兔肝用PHI
0.
00.1mol/L碳酸缓冲液匀浆,按20倍稀释即可酶曲线绘制环节
2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制环节
(6)曲线绘制|以酚含量(微克)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制酚标准曲线注意事项
(一)碱性磷酸前的分解纯化和比活性测定
1、在纯化过程中,各步加入的有机试剂要计算精确
2、加入有机试剂混匀后应立即离心,不宜放置过久
3、在测定酹活性时,每加入一种试剂须立即混匀,避免浑浊
(二)底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
1、血清取量要准确
2、标准曲线必须是过原点的一条直线
3、在酶促反映中,每管加入后立即计时,保证各管反映时间一致环节操作
(1)匀浆2g新鲜兔肝剪碎,加入
0.01mol/L乙酸镁一
0.0lino1/L乙酸钠溶液
6.0ml研磨成匀浆匀浆倒入刻度离心管中记录其体积,此为A液吸取A液
0.1ml于另一试管中Jj[]PH
8.8Tris缓冲液
4.9ml稀释,此为稀释A液(1:50)供此比活性用
(2)除杂蛋白在A液中加入正丁醇
2.0m1用玻璃棒充足搅拌2min室温放置20min用滤纸过滤
(3)丙酮沉淀AKP漉液置于刻度离心管中,加入等体积的冷丙酮,立即混匀离心(2023r/min)5min4AKP溶解沉淀加入
0.5m1/L乙酸镁
4.0ml用玻璃棒充足搅拌使其溶解,记录其体积,此为B液取B液
0.1ml于另一试管中,加入PH
8.8Tris缓冲液
4.9ml此为稀释B液
(150)供动力实验用1加缓冲液取试管3支,按表操作试剂ml测定管标准管空白管PH
8.8Tris缓冲液—---
1.
00.04mol/L底物
1.0I.
01.0液2温浴370c水浴预温5min3加酶和底物
0.1mo1/ni1-——
1.0——-准酚应用液待测
1.0——-一一-液4酶促反映37c准保证温15min5加显色液
0.5mol/LNaOH
1.
01.
01.
00.3%4-氨基安
1.
01.
01.0替比林
0.5%铁氨化钾
2.
02.
02.06显色反映混匀室温放置1Omin7测吸光度51Onm处测吸光度环节操作1反映体系设工.取3支试管,按表操作试剂测定管标准管空白管PH
8.8Tris缓冲—---
1.0液待测酶液
1.0———一蛋白标准液
0.1m----
1.0----g/m1碱式铜试剂
5.
05.
05.02反映混匀后室温放置lOmin3加酚试剂酚试齐IJ
0.5ml4显色反映混匀后室温放置30min5比色反映在510nm处比色环节操作1反映体系设立取6支试管标号,按表操作试剂(ml)
1234560.01mol/l底物
0.
010.
200.
300.
501.00液PH
100.
10.
070.
700.
700.
700.
700.70mol/L碳酸盐缓冲液蒸饰水
1.
101.
000.
900.
700.
201.202保温37c水浴中保温5min3加酹各管分别加入兔肝稀释匀浆液
0.10ml4酶促反映混匀,立即记录时间,将各管准保证温15min5终止反映各管分别加入碱性溶液16加显色剂各管分别加入
0.3%4一氨基安替比林
1.0ml各管分别加入
0.5%铁新化钾
2.0ml7显色充足混匀,放置15min8比色测定以6号空白管作对照,于510nm波长处比色测定9反映速度计算根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量算出反映速度10曲线绘制以各管底物浓度的倒数1/US]为横坐标,以各管反映速度的倒数1/V为纵坐标,作图求出Km值环节操作1反映体系设立取洁净干燥试管6支依次加入试剂试剂(ml)
1234560.1mol/m1酚-一一
0.
050.
100.
200.
300.40标准溶液蒸储水
2.
01.
951.
91.
801.
701.6002预加热37C水浴中保温5min3加显色剂碱性溶液
1.
01.
01.
01.
01.
01.
00.3%4—氨基
1.
01.
01.
01.
01.
01.0安替比林
0.5%铁轨化钾
2.
02.
02.
02.
02.
02.04显色反映混匀后,室温放置15min5比色测定510nm波长处比色。