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文本内容:
AKTAavant操作步骤1实验前准备过膜的超纯水过膜的20%乙醇过膜的
0.5MNaOH过膜的样品剪好的
1.5mLEP管1mL、2mL、5mL注射器2多肽的纯化开机打开仪器开关;打开电脑,等待几分钟后,仪器界面显示Ready;打开软件avant1的密码:defaultssavant
23、4的密码default;在Systemcontrol模块中点击星」弹出ConnecttoSystem对话框,default前勾选,点OK仪器和电脑联机内置收集器的准备注齿轮条码向外放置(Systemcontrol模块—View—Fractioncollectorcontent)水洗泵和管路将入口管Al和Bl浸入超纯水中—Systemcontrol模块—Manual—弹出Manualinstructions—Pumpandpressure—Pumpwash—*InletA Al;InletB Bl;iBufferPro/Qinlet off;Sampleinlet off(此处无盗:特别去设置)-Insert-Execute-置换管路中的20%乙醇-水洗平衡JOmin(没有固定时间,基本上冲到UV_280和cond线平衡了,就可以停止了)后手动停止;水洗了之后,还要再用B液洗去B管路中的水,因此将入口管B1浸入B液中—Systemcontrol模块-Manual—»弹出Manualinstructions—»Pumpandpressure—Pumpwash—InletB Bl;—»Insert一Execute—置换管路中的水一平衡到UV280和cond线平衡,手动停止注意,凝胶柱只需要一种缓冲液,B管路就不需要管,不需要水洗,不需要缓冲液洗,只洗A管路手动上样将2mL上样环与loopE和loopF相连;采用注射器与鲁尔接口相连,大于2mL超纯水(体积至少大于上样环两倍体积)清洗上样环(注水中不可有气泡);将排除气泡的样品用注射器注入上样环中(注注射器不可拔出,不可有气泡);层析柱的准备与连接(这步习惯称为五个参数!)Systemcontrol模块TManual—Manualinstructions—Alarms—Alarmpre-pressure
5.0MPa—InsertAlanns—*Alanndelta-pressure
1.8MPa—InsertPumpandpressure—systemflow ImL/min—Insert►Flowpath—►Columnposition—*Position position
3.Downflow—»InsertFlowpath—*inletA—Position A—Insert—Execute连接柱子待管路中气泡排出-A口与柱子上端连接一水从柱子下端流出后,与排气泡后的B口相连)
2.6编辑方法MethodEditor模块一FileTNewMethod—弹出NewMethod界而TPredefinedMethod—*GelFiltration(凝胶层析)—OKMethodsettings—Columntype:SuperdexPeptide10/300GL—►Columnposition:Position3—Flowrate ImL/min—►UV220nm(蛋白吸收峰是280nm多肽不一样?)Equilibration(层析柱)—Flowrate:ImL/min—Equilibrateuntil thetotalvolumeis2CVSampleApplication(上样)—Flowrate:ImL/min—*Injectsamplefromloop—*Fillloopusing:Manualload—Looptype:Capillaryloop—*Emptyloopwith:4mL一Fractionate-inwaste(donotcollect)(第一次纯化的话,最好都收集)ColumnWash(去除结合的非特异性肽)-Washuntilthetotalvolumeis2CV—Fractionate—inwaste(donotcollect)Elution(目标物)—Flowrate1mL/min—Gradientelution—Linear—TargetB100%-length2CV(洗脱两倍柱体积可能有点少)—►Fractiontype:PeakfractionationsPeakFractionationdestination:3mLtubes(PeakFractionationsettings Mode:Level;Startlevel:50mAuEndlevel:50mAuColumndefault:
0.75min)—Peakfractionationvolume:1mLColumnWash(洗脱液)—Washuntilthetotalvolumeis2CVtFractionate—*inwaste(donotcollect)Equilibration(结合缓冲液A)-Equilibrateuntil thetotalvolumeis2CV方法确定无误后,File—Save或SaveAs保存
2.7多肽纯化确保柱子已经平衡好,在仪器为Ready的状态,将收集管架放入收集器内,通过View-Fractioncollectioncontent查看收集管架是否识别Syslemcontrol模块一点击击,找到自己保存的方法,双击打开一运行实验方法3关机先是洗柱子然后下柱子,不需要洗B管路水•氢氧化钠•水.乙醇洗的过程,要像接柱子那样设置五个参数!水洗将入口管A1和-浸入超纯水中—System■模块fManualf弹出Manualinstzetions—Pumpandpressure-^Systemwash-*^InletA Al;InletB Bl;BufferPro/Qinlet off;Sampleinlet offiSS.五个参数一Execute—清洗柱子至平衡,暂停,Al插入氢氧化钠中,再继续冲洗至平衡,换水冲至平衡,再换乙醇冲至平衡调低五个参数中的流速,下柱子管路L
0.5MNnOH洗4数据处理Evaluation模块一双击打开数据一鼠标右键,选择Customize将要显示测线勾选。