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超详细的真菌检验学习笔记01何为真菌基本特征
①真核细胞型微生物,属于真菌界;
②具有典型细胞核,有完整的细胞器,不含叶绿素,不分根、茎、叶;
③单核细胞或多核细胞组成的;
④细胞壁含几丁质和葡聚糖;
④以寄生或腐生的方式生存,能进行有性生殖或和无性生殖
⑤致病性引起人类感染性、中毒性、变态反应性疾病真菌的分类1分类单位2按形态分
①单细胞真菌酵母菌如新生隐球菌,以出芽方式繁殖,不形成真假菌丝;酵母样菌如念珠菌属,以出芽形成芽管,形成假菌丝
②多细胞真菌并非所有的白念珠菌都形成芽管,需要设阴(热带念珠菌)阳(白念珠菌)性对照培养时间不可过长,热带念珠菌在血清中培养6h或更久也可形成芽管
②厚膜抱子形成试验在玉米粉琼脂上,25028T孵育24-48h念珠菌属中仅白念珠菌产生厚壁弛子
③氯化三苯基四氮嗖反应白念-不变色(淡红)热带-深红色或紫色其它-红色
④商品化显色培养基原理是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理(显色底物由产色基因和微生物部分可代谢物质组成,在特异酶作用下,游离出的显色基因显示一定颜色,观察颜色)翠绿色菌落为白念珠菌,铁蓝色菌落为热带念珠菌,淡粉红色菌落为克柔念珠菌,紫色菌落为光滑念珠菌其它为白色
⑤G试验G试验(13-B-D-葡聚糖)可特异性激活金变形细胞裂解物种的G因子,引起裂解物凝固)G试验检测的是真菌的细胞壁成分一一13-8-D-葡聚糖,人体的吞噬细胞吞噬真菌后,能持续释放该物质,使血液中含量增高原理B-D-葡聚糖能特异性激活反应主试剂中的G因子、凝血酶原等,引起显色基质中酰胺键的断裂,产生能在405nm下的显色物质PNA引起吸光度的变化进行定量检查临床意义适用于除隐球菌和接合菌毛霉菌外的所有深部真菌感染的早期诊断,尤其是念珠菌和曲霉菌,但不能确定菌种以下情况可出现假阳性1使用纤维素膜进行血透,标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料;2静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制口口口;3链球菌血症;4操作者处理标本时存在污染
⑥其他抗原检测、抗体检测、核酸检测隐球菌属.致病特点一般为外源性感染,经呼吸道侵入人体,可由肺经血传播至脑及脑膜,也可侵犯皮肤、骨和关节斯最易侵犯的是中枢神经系统,引起慢性脑膜炎,出现脑膜刺激症状诙新生隐球菌病好发生于体质虚弱,免疫力低下者如白血病、艾滋病、恶性肿瘤、糖尿病等病人荚膜多糖是新生隐球菌重要的致病物质.生物学性状由圆形的酵母型菌,外周有荚膜,折光性强囱一般染色法不着色,难以发现诙非致病的隐球菌在37七不生长,无荚膜▲徐和平/摄.微生物检验1直接检查
①墨汁负染色通常用于检查脑脊液等涂片中的隐球菌,是涂片中检查隐球菌的首选方法标本中菌体较大,呈较大的球型,菌体周围有肥厚的荚膜
②隐球菌荚抗原的检测常见有乳胶凝集法、胶体免疫金层析法、酶联免疫吸附法等▲徐和平/摄
③PCR检测2分离培养菌体常见出芽现象、在沙保弱和血平板上25t和37C均可生长但3TC生长良好,菌落奶白色至棕黄色,粘稠、不透明、边缘完整3鉴定
①尿素酶试验:新型隐球菌+、白假丝酵母菌-
②糖同化及发酵试验新型隐球菌、浅白隐球菌等可同化纤维二糖、肌醇等,但均不能发酵糖类
③酚氧化酶试验接种左旋多巴-枸檬酸铁和咖啡酸培养基,经2-5天,新型隐球菌呈棕黑色菌落曲霉菌.基本特征的多数只发现了无性阶段,囱条件致病菌,最常见的是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉囱可侵犯机体许多部位,尤其是呼吸系统和全身性曲霉病酎呼吸系统曲霉菌病引起支气管哮喘或肺部感染诙全身性曲霉菌病原发病灶主要是肺,可随血播散至脑、心肌和肾等所有些曲霉菌能产生毒素引起机体食物中毒,黄曲霉毒素,杂色霉毒素有致癌作用.生物学特征▲徐春晖/绘组成分生泡子头和足细胞分生袍子头分生梗茎、顶囊、瓶梗梗基、分生抱子链壳细胞厚壁,顶生或间生的囊状细胞▲徐和平/供闭囊壳有性生殖器官,壁薄,由一层或数层多角细胞构成▲徐和平/摄.分离培养曲霉菌在沙保培养基上,室温及37℃〜45℃均能生长形成绒毛状或絮状菌落菌落开始为白色,随着抱子的产生,不同菌种可呈现各种不同的颜色多数菌种只有无性阶段,少数菌种存在有性阶段烟曲霉囱菌落扩延,蓝绿色至烟绿色,背面无色或黄褐色,绒毛状,37〜45摄氏度生长良好诙顶囊烧瓶状单层瓶梗,布满顶囊表面2/3;分生抱子头圆柱形;分生泡子梗无色或绿色、光滑,无闭囊壳所引起肺曲霉病黄曲霉菌▲徐和平/供所菌落表面黄绿色,背面无色或微褐色,羊毛状囱顶囊近球形;单层和/或双层小梗,布满顶囊表面;分生抱子头放射状或圆柱状抱子梗黄绿色、粗糙断引起肺、外耳道曲霉病,甲癣黑曲霉菌由生长迅速,菌落初为白色羊毛状,后为黑色或黑褐色粗绒状,背面无色或略带黑褐色囱顶囊近球形;单层和/或双层瓶梗;分生抱子头球形放射状,褐色至黑色;抱子梗无色至褐色、光滑诙引起外耳道、肺和脓皮症样曲霉其他霉菌士曲霉菌落杂色曲霉菌落构巢曲霉菌落.微生物检验1显微镜检查
①透明胶带法可有效的保持菌落的生长形态,便于观察真菌的产泡子结构及着生方式和泡子的排列方式制片的过程应在生物安全柜中进行,疑为二相真菌,除袍子丝菌外不可采用此法在显微镜下的特征性表现可见较多的分生袍子头,顶端膨大形成顶囊,顶囊上有小梗,小梗上有许多小分生抱子,透明二叉分支形分枝呈45角有隔菌丝黄曲霉菌烟曲霉菌黑曲霉菌
②乳酸酚棉蓝染色法2抗原、抗体的检测包括抗原、抗体及代谢产物检测囱抗原检测抑制性ELISA患者血清中的曲霉菌抗原,如GM试验断抗体检测检测患者血清中抗曲霉抗体,常用免疫扩散,对流免疫、ELISA、放射、间接荧光等由代谢产物G试验检测细胞壁成分1-3-8-D甘露聚糖G试验检+GM试验可提高曲霉的检出率GM试验Galactomannan——目前国际公认的曲霉菌的诊断方法GM试验检测的是半乳甘露聚糖,主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断曲霉菌特有的细胞壁多糖成分是81-5吠喃半乳糖残基,菌丝生长时,半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放,是最早释放的抗原GM释放量与菌量成正比,可以反映感染程度连续检测GM可作为治疗疗效的监测在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高一步法酶免夹心微孔板方法检测人血清中的半乳甘露聚糖,采用鼠EBA-2单克隆抗体,直接和曲霉菌半乳甘露聚糖结合将鼠EBA-2单克隆抗体微孔板并结合抗原,且检测结合到已激活微孔板结合物试剂过氧化物酶连接的单克隆抗体上的抗原将已经过加热处理以便去除免疫复合物和沉淀可能干扰实验的血清蛋白质的EDTA血清样本加入孔中孵育——洗板加底物(显蓝色)加入酸溶液终止反应(蓝色变黄色)——比色(450nm和620/630nm波长的分光光度计(酶标仪)测定样本和对照的吸光度(光密度))丁以下情况可出现假阳性
(1)使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他嗖巴坦;
(2)新生儿和儿童;
(3)血液透析;
(4)自身免疫性肝炎等;
(5)食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等所以下情况可出现假阴性
(1)释放入血循环中的曲霉GM(包括甘露聚糖)并不持续存在而是会很快清除;
(2)以前使用了抗真菌药物;
(3)病情不严重;
(4)非粒细胞缺乏的患03案例分析患者胡某,男,21岁,因“骑车摔伤致胸腹部、腰部疼痛4小时”入院该病人基本特征如下.患者为男性青年,既往体健否认“肝炎”、“结核”病史,否认“糖尿病”、“冠心病”病史,否认食物、药物过敏史,否认重大手术,外伤史.患者约于4小时,骑车摔伤致胸腹部、腰部疼痛,致全身多处流血,伴胸闷,当时神志清楚送我院急查各种炎症指标均增高,临床医生一直在使用抗感染的药物防止细菌感染11月初因患者病情加重,给予气管切开接呼吸机支持呼吸后,与患者血液中检测到白念珠菌,且G试验、GM试验均明显增高临床医生给予卡波芬净等抗菌药物给予治疗,后期检查血中未查到白念珠菌04提提神,动动脑.鉴定曲霉常用的培养基是A、察氏琼脂B、尿素琼脂C、脑心葡萄糖血琼脂D、酵母浸膏磷酸盐琼脂E、沙氏培养基.真菌性脑膜炎最常见的病原菌:A、白假丝酵母菌B、曲霉菌C、毛霉菌D、新型隐球菌E、球抱子菌.属于假丝酵母菌的特点A、革兰染色阳性,着色均匀B、有菌丝和抱子C、无假菌丝D、沙氏培养基生长良好E、菌落呈绒毛状.上呼吸道感染应采集A、鼻咽拭子标本B、咽拭子标本C、痰标本D、支气管镜标本E、胃内标本上期答案
1.E
2.C
3.CE
4.BCE
5.ABCDE(你答对了吗)05教师补充
1、曲霉和毛霉的鉴别要点
①曲霉有隔,毛霉无隔
②曲霉呈透明二叉分支(分枝呈45度角),毛霉无分枝
2、质谱仪将待检菌薄薄涂于靶板上(96孔)加甲酸破坏细胞壁释放出蛋白质等物质待干后加基质与释放出来的蛋白质结合形成结晶,根据结晶大小进行打条带,与质谱库菌进行对比
3、在实验室中一定要注意生物安全,学会保护自己,操作中注意无菌操作
4、G实验鉴别深部真菌(主要是念珠菌)、GM实验鉴别曲霉,都是辅助诊断的的指标,影响因素比较多由菌丝+抱子组成丝状菌(霉菌)形成菌落为丝状型,如曲霉、毛霉、青霉、皮肤癣菌等、各种霉菌的菌丝和抱子形态不同,是鉴别真菌的重要标志「菌丝」呈管状,长度随不同的生长条件而异,是由成熟袍子以出芽方式繁殖时形成的在适宜的环境中由抱子长出芽管,并长出分支而不断生长形成的或有一段菌丝细胞增长而形成,许多菌丝交织成团,成为菌丝体A.按形态不同螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳妆、关节状菌丝等B.按结构不同有隔菌丝是由横隔将管状结构的菌丝分隔成一连串多细胞样的丝状体如霉菌、青霉和毛癣菌菌丝(大多致病菌为有隔菌丝)无隔菌丝无隔膜整条菌丝为单个细胞,细胞质内有多个细胞核,根霉和毛霉的菌丝C.根据菌丝生长方式(功能)不同分营养菌丝伸入到培养基内的菌丝气生菌丝露出培养基表面、向空间生长生殖菌丝气中菌丝可生产有性或无性抱子丝的结构和组成是真菌形态的的一个重要的特征,这有助于对真菌的鉴别「匏子」是真菌的繁殖体,不同的真菌都有其特定的泡子,其形态、大小表面纹饰和色泽等各不相同根据繁殖的方式分为两种A.有性袍子是经过两性细胞接合的繁殖方式,通常经过质配、核配和减数分裂三个过程如抱子菌丝、皮炎芽生菌、石膏样小抱子菌等B.无性抱子(多为病原性真菌繁殖方式)无性担子按形态不同分
①分生抱子真菌中最常见的一种大分生泡子(多细胞性)其大小、细胞数和颜色是鉴定真菌的重要依据体积较大,分隔成较多细胞,长呈梭形,棍棒型,梨形小分生抱子(单细胞性)各种真菌都能产生小分生抱子,鉴别意义不大体积小,单细胞性外壁薄,有球型,卵形,梨形以棍棒状等各种不同的形态及
②叶状袍子菌丝内细胞直接形成芽生袍子由细胞出芽生成,多数芽生抱子生长到一定大小即与母体脱离,若不脱离,形成菌丝状,被称为假菌丝关节抱子菌丝生长到一定阶段后,出现很多横膈膜,然后从横隔膜处断裂形成矩形、筒形或短柱状的抱子多出现与陈旧的培养物中厚膜抱子菌丝或分支的顶端有少数细胞有菌丝内胞质浓缩、薄壁增厚形成,是为了抵抗不良环境,真菌的一种休眠体环境适宜时又可出芽繁殖
③苑子囊抱子菌丝分支的顶端或袍囊梗膨大形成抱子囊,内含许多抱子,泡子成熟后则破囊而出如毛霉、根霉等形成的抱子囊抱子02真菌检验的基本技术
1.标本直接镜检•生理盐水•透明胶带法.染色镜检法革兰染色为革兰阳性,为深紫红色墨汁染色法乳酸酚棉蓝染色法荧光染色糖原染色PAS真菌及组织内的多糖多糖-红色;核-蓝色;背景-淡绿色银染色法吉姆萨染色、瑞氏一吉姆萨染色法病理组织染色法.真菌培养及鉴定1培养方法点植法划线法直接培养与间接培养试管培养平板培养大培养小培养玻片法、方块法、小钢圈法
(2)培养条件pH一般在
5.0-
7.0(大部分真菌适应中性或偏酸环境);温度多25-282,深部真菌一般37寸;二相真菌26七左右,为菌丝相,37℃酵母相渗透压
(3)常用真菌培养基.培养真菌的菌落形态
①酵母型菌落(类似一般细菌菌落)菌落光滑、湿润、柔软、致密,似酵母为单细胞真菌的菌落,以出芽方式繁殖,如新型隐球菌显微镜检可见圆形或椭圆形生芽细胞
②类酵母型外观性状同酵母型菌落,但除有生芽细胞外,还有假菌丝伸入培养基中,是由伸长的芽生抱子形成如白念珠菌
③丝状菌落菌丝疏松,呈棉絮状、绒毛状或粉末状等,一部分菌落向上生长并形成抱子,一部分深入培养基下层菌丝正面和背面可显示各种不同的颜色,常作为鉴定菌种的参考.临床标本的真菌学检查
(1)根据标本类型分为
①血液标本
②骨髓标本
③中心静脉导管标本
④脑脊液标本
⑤痰、肺泡灌洗液、保护毛刷标本
⑥分泌物标本
⑦尿液标本
⑧粪便标本
(2)根据侵袭部位分皮肤黏膜感染性真菌:
①皮肤癣真菌毛癣菌属表皮菌属只有絮状表皮癣菌致病小担子菌属
②表面感染真菌
③皮下组织感染真菌引起头癣、足癣、股癣、甲癣、体癣引起侵袭性感染性真菌
①酵母型真菌念珠菌属、隐球菌属
②丝状真菌曲霉、毛霉、镰刀菌属
③卡氏肺抱菌
④二相性真菌组织胞浆菌、马尔尼菲青霉、粗球抱子菌、副球泡子菌「二相性真菌」二相性有些真菌可因营养、温度、颜色等环境的改变,二两种形态发生互变二相性真菌在体内或体外含动物蛋白的培养基上37P培养为酵母型真菌;在体外普通培养基上251培养为霉菌型真菌,如球袍子菌、组织胞浆菌、芽生菌和抱子丝菌、副球泡子菌03实验室常见真菌念珠菌属.分类念珠菌属Candida假丝酵母菌属生物学上属于半知菌亚门,该属菌有150多个种,常见致病的有11种白念珠菌Candidaalbicans白假丝酵母菌为最常见的致病菌白念珠菌C.albicans热带念珠菌C.tropicalis克柔念珠菌C.krusei光滑念珠菌C.glabrata季也蒙念珠菌C.guilliermondi维斯念珠菌C.viswanathii近平滑念珠菌C.parapsilosis都柏林念珠菌C.dublinniensis星形念珠菌C.stellatoidea克菲念珠菌C.kefyr.临床意义分布与自然界,通常存在与人的体表、口腔、上呼吸道、肠道和阴道黏膜大多是人体正常菌群,感染可以是内源性的,也可是外源性的可侵袭多个部位,引起浅部和全身性感染白念女性的念珠性阴道炎、外阴炎;男性念珠菌龟头炎、包皮炎体质虚弱的婴儿鹅口疮念珠性阴道炎、外阴炎、肺炎、膀胱炎、肾盂肾炎和心内膜炎中枢神经系统白念珠菌病脑膜炎、脑膜脑炎、脑脓肿等热带先天性免疫缺陷的致病菌,可引起皮肤、黏膜和内脏念珠菌病克柔引起系统性念珠菌病,特别是先天性免疫缺陷患者和大量接受抗菌药物治疗的患者光滑人体一种腐生菌,可导致泌尿生殖道感染,也是新生儿的条件致病菌.生物学性状
①菌体圆形或卵圆形,革兰阳性,着色不均匀
②以出芽繁殖,形成米色或灰色的酵母样菌落,有时表面有褶皱
③组织内可见芽生抱子和假菌丝玉米粉培养基假菌丝、厚膜袍子墨汁染色阴性--没有荚膜.微生物检查学
①直接镜检一般用于浅部念珠菌的检查,也可用于血、尿、脑脊液、活检组织等标本的检查显微镜下观察,呈圆形或卵圆形的芽生袍子,假菌丝和菌丝克柔可见假菌丝成对分枝,有细长的芽生袍子;光滑可见卵圆形芽生袍子,细胞尖端单芽,无真假菌丝不产生厚膜袍子
②分离培养及鉴定可接种于沙保弱、血平板等培养基沙保弱培养基,25七或37T培养1-4天白念珠菌乳白色、奶油色、隆起、表面湿润、光滑类酵母型菌落,镜检可见假菌丝和芽生抱子;热带念珠菌乳白色至奶油色、隆起、无光泽、或稍有光泽的菌落;克柔念珠菌生长快,菌落大,呈柔软、乳白色至乳黄色菌落光滑念珠菌421可生长,25或37培养3日,形成光滑、湿润、隆起、白色和奶油色乳酪样较小菌落.念珠菌的鉴定方法
①芽管形成试验待测菌加
0.5〜1ml人或动物血清——镜检(37℃水浴
1.5-4h)结果绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管。