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丙酮酸脱竣酶(PDC)活性测定试剂盒说明书微量法100T/96S注意正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定测定意义PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱竣生成乙醛测定原理PDC催化丙酮酸脱竣生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340nm光吸收下降速率,来计算PDC活性自备仪器和用品研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸镭水试剂组成和配制试剂一液体lOOmLxl瓶4℃保存试剂二液体18mLxl瓶,4℃保存试剂三液体
2.5mLxl瓶,4℃保存试剂四粉剂xl支,-20℃保存试剂五液体30比乂1瓶,-20℃保存混合试剂临用前配制,将试剂四和试剂五转移至试剂三中充分溶解待用,用不完的试剂分装后・20℃保存禁止反复冻融试剂六液体2mLxl管,4℃保存粗酶液提取
1、细菌或细胞处理收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400nL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率200W工作3s间歇10s工作35次),16000g4℃离心20min取上清,置冰上待测
2、组织处理按照组织质量(g)试剂一体积(mL)为15〜10的比例(建议称取约
0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,16000g4℃离心20min取上清,置冰上待测
3、血清(浆)样品直接检测PDC测定操作.分光光度计/酶标仪预热30min调节波长到340nm蒸储水调零.试剂二置于25℃水浴中预热30min.空白管依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20rL蒸锵水、20注混合试剂、140nL试剂二和20皿试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A1和A
2.测定管依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20匹上清液、20匹混合试剂、140HL试剂二和20国试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A3和A4注意空白管只需测定一次PDC活性计算a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下1按照蛋白浓度计算活性单位定义25°中,每毫克蛋白每分钟催化InmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/mgprot={[A3-A4-A1-A2]-s-dxV总xl9}CprxV样=1608x[A3一A4一A1-A2]-Cpr2按照样本质量计算活性单位定义25c中,每克组织每分钟催化InmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/g鲜重={[A3-A4-A1-A2]-8-dxV总xlOXWxV样V样总:T=1608x[A3-A4—A1-A2]^W3按细胞数量计算活性单位定义25C中,每IO个细胞每分钟催化gmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/104cell={[A3-A4-A1-A2]-e-dxV总xlO.细胞数量xv样:V样总:T二1608x[A3—A4—A1-A2上细胞数量4按血清浆体积计算活性单位定义25℃中,每毫升血清浆每分钟催化InmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/mL={[A3—A4—Al・A2]+£+dxV总xl9}v样T=1608x[A3-A4-A1-A2]8NADH摩尔消光系数
6.22x103L/mol/cm;d比色皿光径,1cm;V总:反应体系总体积
0.2mL=2xl0-4LV样加入反应体系中上清液体积,
0.02mL;V样总提取液体积,1mL;Cpr蛋白浓度mg/mL需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W样品质量;T反应时间,1minb.使用96孔板测定的计算公式如下1按照蛋白浓度计算活性单位定义25c中,每毫克蛋白每分钟催化InmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/mgprot={[A3-A4-A1-A2]-s-dxV总xlO9}《CprxV样4-T=3215x[A3-A4—A1-A2]^Cpr2按照样本质量计算活性单位定义25℃中,每克组织每分钟催化InmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/g鲜重={[A3-A4-A1-A2]-8-dxV总xlO9}《wxV样样总=3215x[A3一A4一A1・A2]・W3按细胞数量计算活性单位定义25℃中,每IO个细胞每分钟催化gmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/104cell={[A3-A4-A1-A2]-8-dxV总xl9}细胞数量xv样;V样总=3215x[A3-A4一A1・A2—细胞数量4按血清浆体积计算活性单位定义25℃中,每毫升血清浆每分钟催化InmolNADH氧化为1个酶活单位PDCnmol/min/mL={[A3-A4-Al-A2]-8-dxV总xlO.v样T=3215x[A3-A4-A1-A2]8NADH摩尔消光系数,
6.22x103L/mol/cm;d96孔板光径,
0.5cm;V总反应体系总体积,
0.2mL=2xl0-4LV样加入反应体系中上清液体积,
0.02mL;V样总提取液体积,1mL;Cpr蛋白浓度mg/mL需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W样品质量;T反应时间,1min。