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OB中华人民共和国彖标准GB/TXXXXX—201X蛋白酶K酶活力及杂质检测方法DetectionmethodofactivityandimpurityofproteinaseK201X-XX-XX发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/Txxxx一201x蛋白酶K酶活力及杂质检测方法1范围本标准规定了蛋白酶K检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析本标准适用于生化试剂蛋白酶K产品的生产、监督和检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/Txxxx核糖核酸酶活力检测GB/Txxxx脱氧核糖核酸酶活力检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件1蛋白酶K(proteinaseK)能水解天然角蛋白(keratin)的一种丝氨酸蛋白酶
3.2蛋白酶K酶活力单位(proteinaseKactivityunit)在57c和pH80条件下,在1min内水解血红蛋白产生相当于1umol酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量,为一个酶活力单位,以U表示4原理蛋白酶K具有很高的水解活性,可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的竣基端肽键断裂它在57℃和pH
8.0条件下,水解血红蛋白底物产生含有酚基的氨基酸;在碱性条件下,可将福林(Folin)试剂还原,生成铝蓝与鸨蓝,其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比通过在680nm测定其吸光度,得到酶解产生的酚基氨基酸的量,进而计算蛋白酶活力5仪器设备及器具恒温水浴锅精度为±
0.2℃opH计精度为
0.1pH单位分光光度计波长范围380~780nm吸光度值精确至
0.001GB/Txxxx—201x
5.4比色皿1cmo
5.5电子天平精度为
0.0001g和
0.01g6高速离心机最小离心力为8000Xg具
1.5mL离心管6主要试剂本方法所用试剂均为分析纯,除特殊说明外,实验用水均为GB/T6882规定的二级水
10.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液Tris-HCIpH
8.0称取三羟甲基氨基甲烷Tris
12.11g加入适量水使其溶解,定容至100mL用浓盐酸调至pH8即成1mol/LTris-HCl缓冲液再取1mL1mol/LTris-HCl缓冲液,力口水定容至100mL即成
0.01mol/LTris-HCl缓冲液
6.
20.4mol/L三氯乙酸溶液称取三氯乙酸
65.40g用水溶解并定容至1000mL31mol/LHCI溶液取
8.50mL浓盐酸加入到50mL水中稀释,然后定容至100mL得1mol/LHC1溶液
0.1mol/LHCI溶液取
10.00mL1mol/LHC1溶液加水定容至100mL得
0.1mol/LHC1溶液1%w/v血红蛋白溶液准确称取血红蛋白
1.00g用
0.01mol/LpH
8.0的Tris-HCl缓冲液溶解,并定容至100mL此溶液在4℃冰箱贮存,有效期为3天
60.4mol/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠
42.40g用水溶解并定容至1000mLo7福林Folin试剂于2000mL磨口回流装置加入鸨酸钠Na2WO
4.2H2O
100.0g>铝酸钠Na2MoOCWO
25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL小火沸腾回流10h取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂Li2soQ50g、水50mL和数滴浓滨水再微沸15min以除去多余的浪,至冷却后无绿色加水定容至1000mLo混匀,过滤试剂应呈金黄色贮存于棕色瓶内,避光保存使用时,用1份福林试剂与2份水混匀,制成稀福林试剂也可将商品化福林试剂按照产品使用指南稀释成稀福林试剂8100Ug/mLL-酪氨酸标准溶液称取预先于105c干燥至恒重的L-酪氨酸
0.1000g用20mLimol/LHCl溶液溶解后,再用水定容至100mL即为1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液,在4c冰箱贮存临用前,吸取1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液
10.00mL用
0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL即得到100ug/mL的L-酪氨酸标准液核糖核酸酶(RNase)按GB/Txxxx-201x进行检测脱氧核糖核酸酶(DNase)按GB/Txxxx-201x进行检测酶活力标准曲线绘制按表1在10mL容量瓶中配制L-酪氨酸标准工作溶液表1L-酪氨酸标准工作溶液配制分别吸取L-酪氨酸标准工作溶液
1.0mL于具塞试管中(每个浓度作2个平行),然后加入
5.0mL碳酸钠溶液和
1.0mL稀福林试剂,混匀将标准管同时置于40c水浴,反应20min取出,用冷水迅速冷却至室温,用分光光度计,在680nm波长下,以不含酪氨酸的0号管为空白,用1cm比色皿,测定吸光度(A)o以吸光度A为纵坐标,以L-酪氨酸的浓度C为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)得出线性回归方程和回归系数(R2)回归系数在
0.9990及以上时,方可使用,否则应重做新配制的福林试剂应制作新的标准曲线
3.2固体待测样品制备称取
0.0050g固体酶精确至
0.0001g用
0.01mol/LpH
8.0的Tris-HCl缓冲液溶解并稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范围内.3液体待测样品制备吸取100gL液体酶,用
0.01mol/LpH
8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范围内u.4测定取3支10mL具塞试管,样品空白管1支,样品管2支分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液LOmL在57℃下水浴预热5min向2支样品管中加入LOmL经同样预热的1%血红蛋白溶液,准确计时反应lOmin;迅速、准确地向3支试管中加入
2.0mL
0.4moi/L三氯乙酸溶液;于样品空白管中加入
1.0mL1%血红蛋白溶液,混匀3支试管继续在57℃下水浴10min取出,迅速冷却至室温,11000xg离心5min另取3支10ml具塞试管,样品空白管1支,样品管2支,分别吸取上述相应上清液
1.0mL于3支试管,然后均加入
5.0mL碳酸钠溶液、LOmL稀福林试齐I」,混匀,40℃水浴20min显色迅速冷却至室温与此同时,另取1支试管,用水代替上清液做试剂空白,均加入
5.0mL碳酸钠溶液、
1.0mL稀福林试剂,混匀,40℃水浴20min显色,迅速冷却至室温以试剂空白管调仪器零点用分光光度计于波长680nm下,用1cm比色皿,分别测定样品空白管(A)和样品管中样液的吸光度(A)将样品管与样品空白管吸光度之差取平均值,经线性回归方程求解生成的酪氨酸浓度(C-Co)8结果分析酶活力计算按照式
(1)计算(C-C0)x4xN八一11)MxlOxCv式中X蛋白酶K样品的酶活力(U/mL或U/g);C样品管的酪氨酸浓度(ug/mL);Co样品空白管的酪氨酸浓度(ug/mL);4酶反应体系的总体积(mL);N酶样品溶液的稀释倍数;M L-酪氨酸的摩尔质量(
181.20g/mol);10反应时间(min);Cs酶样品溶液的浓度(mL/mL或g/mL)以平行样的平均值为最终的酶活力测定值,计算结果保留整数位重复性在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%o本标准按照GB/T
1.1—2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口本标准起草单位本标准主要起草人本标准按照GB/T
1.1—2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口本标准起草单位本标准主要起草人管号酪氨酸标准工作溶液的浓度(|ig/mL)100|ig/mL酪氨酸标准溶液(mL)水(mL)
00.
00.
0010.
00110.
01.
009.
00220.
02.
008.
00330.
03.
007.
00440.
04.
006.
00550.
05.
005.
00660.
06.
004.00。