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四、WESTBLOTTINGWesternBlot详解原理、分类、试剂、步骤及问题解答Western免疫印迹WesternBlot是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测对表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进展检测，对基因的表达产物，可通过融合局部的抗体检测本文主要通过以下几个方面来具体地介绍一下WesternBlot技术
一、原理
二、分类.放射自显影.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色
三、主要试剂
四、主要步骤
五、试验常见的问题指南.参考书推举.针对样品的常见问题.抗体.滤纸、胶和膜的问题.Marker的相关疑问
6.染色的选择.参照的疑问.缓冲液配方的常见问题.条件的摸索.方法的介绍.结果分析WesternBlot中抗体的重复应用问题解答抗体工作溶液一般不主见储存反复使用，但是如抗体比较贵重，可反豆使用2—3次稀释后应在2一3天内使用，4度保存，避开反复冻融
4.滤纸、胶和膜的问题NC膜PVDF膜尼龙膜怎样鉴别？解答尼龙膜是较抱负的核酸固相支持物，有多种类型硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最廉价；PVDF膜介于者之间就结合力量而言尼龙膜结合DNA和RNA力量可达480—600Rg/cm2可结合短至lObp的核酸片段硝酸纤维素膜结合DNA和RNA力量可达80—100啥cm2对于200bp的核酸片段结合力量不强PVDF膜结合DNA和RNA力量可达125—300咯七1112就温度适应性而言尼龙膜经烘烤或紫外线照耀后，核酸中的局部喀喔碱基可与膜上的正电荷结合硝酸纤维素膜依嵬疏水性相互作用结合DNA结合不结实PVDF膜结合结实，耐高温，特别适合于蛋白印迹就韧性而言尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易裂开；PVDF膜较强就重复性而占尼龙膜可反复用于•分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用Y.在做WesternBlot时PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更简洁跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的Z.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？解答可以AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一恻）的转膜好象不是很好，为什么？解答这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子••端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活CC.承受tanksystem有什么讲窕？解答建议低电压，长时间，L一般tankSystem用衡压好点），如28Vl4-16hrsDD.做HSPWESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WeslcrnBlot和IHCEE.膜一般要如何处理？解答一般用甲醇泡泡就可以了FF.假设是6x8转印膜要加多少一抗解答一抗的稀释度是有说明的，依据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5mloGG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能到达最正确效果解答无要求HH.跑电泳的时候配的股总是“缩”是什么缘由呢？是有的成分不对吗？解答没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了假设过夜，胶里的水分被蒸发，承受保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重配制一份观看；能够替换的试剂，尽量换一3选用好的试剂，避开找问题麻烦脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩n.膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答假设是用的是半干转，挨次为阴极一》趣一》胶一》膜一》滤纸滤纸的长宽分另此眼小1一2mm而膜的长宽分别比胶大I-2mm确定禁忌上下两层滤纸由于过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分别小21KD中至66KD大至170KD可以一次做好吗？解答这么广的分布不好转移，一般建议21kd和66kd可以一起转，I2%SDS-湿转36V3—5hrs就可以了，可以依据你试验室的阅历调整170kd用7%SDS-48V10hrs-l6hrsoKK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？解答可以考虑转移缓冲液中参加20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》），由于甲醉可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合力量，甲砰可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量能白质可延长转移时间；转移缓冲液参加终浓度
0.1%SDS也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（
0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6%太大时还可以考虑用琼脂糖胶提高转移电压/电流增加转移时间LL.如何选择最适宜的蛋白杂交膜？解答蛋白质印迹杂交是分子生物学试验中极为常用的一门技术选择质量上层、符合要求、便利适用的杂交膜是打算这项试验成败的重要环节依据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格匕都要做出合理的选择硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是格外清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用在非离子型的去污剂作用卜，结合的蛋白还可以被洗脱卜.米依据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜由于随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越结实但是膜孔径假设小于
0.1mm蛋白的转移就很难进展了因此，我们通常用
0.45pm和
0.2pm两种规格的硝酸纤维素膜大于20kD的蛋白就可以用
0.45pm的膜，小于20kD的蛋白就要用
0.2pm的膜了，假设用
0.45pm的膜就会发生“BlowthroRgh”的现象从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量硝酸纤维素膜的结合力量主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素、因而降低了蛋白的结合量SS公司承受的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150Ng/cm2由于100%的纯度，因而也大大削减了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用PVDF转移膜PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分别小片段的蛋白质，最初是将它用丁蛋白质的序列测定，由于硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就查找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序抱负的用品，始终沿用至今PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进展各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围这种PVDF膜，灵敏度、区分率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，格外适合于低分子量蛋白的检测但PVDF膜在使用之前必需用纯甲酥进展浸泡饱和1-5秒钟离f交换型转移膜硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是依据离子交换的方式结合生物大分子的由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子其最适的pH环境为5-7DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的争论这种
0.45pm孔径的DEAE膜，除了nJ•以做WesternBlotting外，还可以用于核酸结合争论还有一种离子交换型膜是按甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-70结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于筑基酸系列分析或微测序.Marker的相关疑问MM.我用的是可视marker]BIO_RAD）但是电泳总制不全8条带，请问什么缘由？怎样改善？胶用过8%10%12%都是这样marker是买的解答•般来说，是小分子量Marker跑走「，增加胶浓度或削减电泳时间试试看固然梯度胶也是不错的选择NN.用的是RochemolecularBiochcmicals公司的由lOOkd.75kd45kd»30kd20kd»lOkd组成的marker开头做WesternBlot时还能够看到marker固然也仅能观察其中最多三条带用80V进展SDS-电泳，用恒压10V45min转印的前几次做WesternBlot时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带消灭再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酣联抗体（Anti-V5-HRP）但就是出不来结果，我很茫然感谢您过蜴予教导！解答
1、“我用的是RochemolecularBiochemicals公司的由1OOkd.75kd45kd»30kd20kd»lOkd组成的marker开头做WesternBlot时还能够看到marker固然也仅能观察其中最多三条带”有的时候PrestainedMarker放久了效果就会变差，电泳是条带不清楚，集中但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不严密转移是多加点甲醇
2、“前几次做WesternBlot时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带消灭”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好
3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP］”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性比照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到
1.5hrs.染色的选择OO.WesternBlot哪种染色好？解答
（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可到达l.5Mg考马虽然与筑基黑有一样的反敏度，但脱色慢，背景高丽春红S和快绿在检测后简洁从蛋白质中除去，以便进展随后的尔基酸分析缺点是溶剂系统的甲醉会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏不能用语正电贺的膜灵敏度低
（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定
（3）生物索化灵敏度位于
1、2之间，可用于任何一种膜.参照的疑问PP.是否WesternBlot试验半定量肯定要加ACTIN内参？解答对于发表文章的试验最好加内参，试验严谨QQ.用BANDSCAN分析结果行吗？解答分析一般的结果没问题RR.核内抗原WesternBlot内参选择什么适宜？解答可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参SS.转膜时承受电流是否比电压准确，是否依据
0.8mA/cm2一般I小时左右？解答不是的，半干法推举用恒流，一般依据目的蛋白的大小来确定电流和时间TT.做半定量人卵巢癌细胞系的WesternBlot内参B-actinGAPDH那个好？解答选用bela-actin就可以.缓冲液配方的常见问题UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCI是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉Tris-HCI就是Tris盐用HCI调ph位，配置而成VV.预备做大鼠脑子的WesternBlot蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必需要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去璘酸化WW.想问一卜细胞裂解液选择蛋白酹抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区分吗？解答一般来说提取时参加光谱的蛋白的抑制剂就可以了，操作时保持低温除非有文献特别指明用特别的方法，一般来说都没有区分XX.最近作了两次WesternBlot不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题
1、检测GAD--分子量67kd提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测
2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100假设是一抗的缘由，不会背景都没有把？
3、第•次有不均匀背景，由于一抗过夜时密封袋不均匀后两次无背景显色
4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST漂洗液用的是含1%BSA的TBST液TWEEN-20为
0.1%不会是封闭液的问题吧？解答可以在下面几个问题上找找缘由
1.封闭液用5%Milk漂洗液washingbuffer用TBST
2.看看一抗是否能work降到I
203.看看二抗是否有问题YY.加甲醉的目的是什么？解答加甲醉起着肯定的固定作用，由于小分子蛋白质简洁转出去.特别是在硝酸纤维素膜上，由于NC膜结合蛋白质的力量较弱ZZ.”转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最终那个T是Tween吗，浓度多大？解答是Tween配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20TBSTDissolve
8.8gofNaCl
0.2gofKCLand3gofTrisbasein800mlofdistilledH20Add500ulofTween-20AdjustthepHto
7.4withHCIAdddistilledH2OtoILSlcrilizcbyautoclaving.AAA.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比方现在我就在室温里做，或者要在4度下？解答均可在室温进展，假设时间不够，一抗孵育可以先在室温进展一个小时，然后4度过夜BBB.试验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫胭提取膜蛋白吗？配方如卜.7M尿素，2M硫腺，Triton-x-
1000.2mL颖参加65mMDTT蛋白酶抑制剂:试剂盒HaltTMProteaseinhibitorcocktailkitl%（v/v）是用于抽提双向电泳用蛋白的配方不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改进的R1PA裂解缓冲液（Tris.HCL50mmol/LpH
7.5;NaCI150mmol/L;NP-401%;脱辄胆酸钠，（）.5%;SDS
0.1%;EDTA1mmol/L;PMSF1mmol/L;Leupeptin2ig/ml）不知对于膜蛋白效果如何此外该方中的EDTA是否用做蛋白粉抑制剂？解答做2—D确定不推举使用NP—40（山丁•即使进口的NP—40也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail由于7M尿素+2M硫肥+4%CHAPS构成的变性环境已经足以抑制大局部蛋白酶的活性，2M硫服+4%CHAPS对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过假设您专职做膜蛋白建议承受分级抽提法此外还可以承受梯度离心法和一些基于去垢剂的方法EDTA用于灭活金属蛋白酶（主要是其整合作用）加过多的蛋白布抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做WB无所谓，做MAILDI时会给正确鉴定带来麻烦裂解缓冲液中少了两性电解质（在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用供给连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一局部核酸）也不推举承受SDS因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生转变，假设您实在要用，终浓度降到
0.1%以下METHOD2（50ml总量）-mercaploethanol342^120%SDS5ml；Tris-CIpH
6.
73.125ml加ddH2O至50ml方法将用过的膜浸入strippingbuffer中置50℃水浴箱中30min连续振摇之后用TTBS洗3*5min就好此时你已经可以按的转移好的膜来再次使用了该方法的优点省事，省力，省钱，符合国际惯例METHOD
31、beta-metaptoeihanol35ul
2、10%SDS1ml
3、tris（
0.5MpH
6.7）625ul
4、dH
203.34ml50-5530minoMETHOD4strippingbuffer应当是可以放置很久的不过我习惯于现配——到底，加了p-mercaptoethanol以后太难闻了，配了就用；而且有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液现配还是很便利的每次用量5ml少了点，我每次用50mLMETHOD
50.5MNaCl
0.5MHAc室温摇床15minoMETH0D6将用过的膜泡在l*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加I•抗，二抗（同第•次发光），实践证明方法完全可行不管用那种方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次.条件的摸索DDD.用的是SamaCruz的抗体，也试验过一抗和二抗确定能结合，二抗加DAB确定能显色电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）半干法2小时转膜后，明春红染色觉察大分子量蛋白转过去的较少莫非是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加趣氮钠和或许叫Apoplin的那种蛋白能抑制剂冰上裂解-80度冻存的细胞，4度12023g离心5分钟，取上清，与分子克隆（其次版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样不知道是哪里出了问题？解答建议
1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应当在几-20微克/微升
2、假设是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD建议分别用10%和12%的胶60-80V1小时左右跑过积层胶与分别胶的线时，换用100V3-4小时
3、转膜，建议恒压，15V不用转2小时，45分钟足以您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是由于在提的蛋白中大蛋白本身就很少我曾经也转过2小时，但和45分钟的区分并不大
4、依据MARKER的条带（我的是7条带
14、
18、
25、
35、
45、
66、116KD）您依据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带这样第一，可以节约抗体，其次，您要的目的条带确定在上面
5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度
6、我买的也是SantaCruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应领先找其他方面的绿由EEE.电泳用的是恒流，一块胶，20mA100分钟左右转膜也达恒流，38mA100分钟而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不同所以，我想问题应当出在抗原和一抗上，不知对不对解答电泳的条件样品的分子量打算了胶的浓度，•般使样品跑至胶的中部即可正常条件下，电泳时・澳酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起由此可以打算电泳的电压和时间建议你用恒压80-100伏FFF.BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热乂比较差，滤纸的吸水性比较差的状况下，就很简洁烧胶就转膜时，是实行恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一我感觉我这个系统用恒流很简洁烧胶，我的胶有68cm2用50mA恒流来转膜，刚开头电压就很高，有20v左右，而用恒乐，开头电流有110mA但15min后，电流就降到80rnA30min后就稳定在40mA不就相当于恒流吗？解答恒流时电压渐渐上升的绿由是湿滤纸渐渐变干因而电阻渐渐增大的原因，假设电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以抑制就我的感觉，20v的电流30min以后20Kd以下的分子•丧失很多，不过我用的是小胶40cm2不知有无不同GGG.我想尽量提高转膜的效率（我的试验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些方法？解答不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不行得兼呵呵建议把胶切成两半，比方以35KD为界，分别进展转膜，下半时间短，上半时间长一点，应当会好一些HHH.请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？解答一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白简洁抻下来，结果较差尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好III.L煮好后的样品，假设没有准时上样分别，应如何保存，可以保存多久？
2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？
3、湿式转移时是否必需要用bio-rad的专用滤纸？
4、恒压转移的条件如何确定，由于我要分别小至21KD中至66KD大致170KD的蛋白质，转移条件能够一样吗？
5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分别的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分别，只是就不是线性范围了？解答
1、煮好后的样品，放到-20我们在一个月后此样品，效果一样
2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-RadUSA上有
3、转移时•般的WATERMEN滤纸就可以
4、转移条件是和蛋白质大小有关的以次确定电压和时间具体可让piglab帮你定夺
5、凝胶的浓度也是和分别蛋白质大小有关不是随心所欲选的，否则分别效果可能不是你所期望的JJJ.怎样设计试验来确定最正确的条件？解答任凭说一点，具体的还是需要自己想
1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1个大well不插梳子，多上样，）SDS-
2、转移，设定电流或电压
3、每隔1（orn）小时，取一点膜染色，看转移效果KKK.我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法sirip最好，我用甘氨酸（PH
2.9）漂洗15分钟，似乎没什么效果？解答你可以加茨基乙醉（loadingbuffer一样的浓度），56度，30mins看看LLL.
1、在用PBS洗涤抗原•抗体-ProleinA-Agarose复合物时，每次要重悬多长时间适宜？
2、最终用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后，由于2XSDS中已经参加了澳芬兰，因此下面的Agarose珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢？原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesiernBlot承受的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗经过分别的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分别的多肽类型及其生物学活性不变以固相我体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的其次抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分别的特异性目的基因表达的蛋白成分该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和试验条件的是用第•种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL只要买现成的试剂盒就行，操作也比较箍洁，原理如下二抗用HRP标记反响底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带
三、主要试剂
1、丙烯酰胺和NN1亚甲双丙烯酰胺，应以温热以利于溶解双丙稀酰胺的去离子水配制含有29%w/v丙稀酰胺和1%w/vNN-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29gNN-亚甲叉双丙稀酰胺1g加1120至100ml储于棕色瓶，4c避光保存严格核实PH不得超过
7.0因可以发生脱筑基反响是光催化或碱催化的使用期不得超过两个月，隔几个月须重配制如有沉淀，可以过滤
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%w/v
0.lgSDSlmlH2O去离子水配制，室温保存
3、分别胶缓冲液:L5mmol/LTris-HCLpH
8.8:
18.15gTris和48mlimol/LHCL混合加水稀料到100ml终体积过滤后40C保存
4、浓缩胶缓冲液05mmol/LTris-HCLpH
6.8:
6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48mllmol/LHCL调至pH
6.8加水稀释到100ml终体积过滤后40c保存这两种缓冲液必需使用Tris碱制备，再用HCL调整PH值，而不用Tris.CL.
5、TEMED原溶液NNN，N*q甲基乙二胺催化过硫酸钺形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合PH太低时，聚合反响受到抑制10%w/v过硫酸胺溶液供给两种丙稀酰胺聚合所必需的H由基去离子水配制数mL临用前配制.
6、SDS-加样缓冲液:pH
6.
80.5niol/LTri$缓冲液8mL甘油
6.4ml10%SDS
12.8ml笳基乙醇
3.2ml
0.05%溪酚蓝L6mLH2032ml混匀备用按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后解答
1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了
2、加2XBUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时留神点就是了我也试过一些次，首先离心略微长一点，长20秒吧，期望胶粒能沉得结实点（我想象的），再吸取假设感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是遇到胶粒了很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了MMM.磷酸化抗体的检测样本制备时是否肯定要加NaF等？解答NaF是一种广谱璘酸化酶的抑制剂，一般最好加但是不加也可以，大局部时候是不用加的我做的时候从未加过，都做出来了NNN.WesternBlot中block的最短时间？解答每•步1小时足够了，中间换抗体要洗的话多换液几次，每次时间10分钟就够，洗3次只要半小时跑胶1小时，转移1小时，block半小时就行，1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半小时，显色10分钟一般跑两块胶，一块染色，一块westemo一天确定完事，一般不用等到其次天OOO.想用Western检测基因转染后细胞培育上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD浓度约为几百ng/mU蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Westernblot时需特别留意哪些条件？解答依据你供给的浓度，假设做WesternBlot是不用浓缩样品的.对•于20kd的小分了的蛋白，WesternBlot中要留意的是
1、转移时的时间，
2、转移时的电流或电压.
3、transferbuffer中加20%的甲醇.
4、可以用
4.15%的分别胶.PPP.蛋白分子量大小分别为21kd、28kd用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较适宜？解答分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了干转的话，用
2.5A/cm230min就应当够了湿转，依据bio-rad的说明，用100mA也得要半个多小时吧QQQ.需要测同种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？解答将膜放入strippingbuffer（SDS2%TrisCi（PH=
6.7）
62.5mM»beta■/基乙BlOOmM）中50*C孵育30分钟，TTBS西二次，再重参加一抗，进展另一种抗原的检测RRR.做WestcrnBlol试验时，觉察转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低.100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多解答有可能重复使用了转移缓冲液，随着离广的渐渐削减，电阻越来越大，固然恒压时电流越来越小了建议更换转移缓冲液反复使用不要超过三次环境温度低是有利于转移的SSS.我电泳用的是恒流，一块胶，20mA100分钟左右转膜也是恒流，38mA100分钟而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不同所以，我想问题应当出在抗原和一抗上，不知对不对一抗我买的是单抗，推举的稀释度是1100——11000我用的是1100莫非非要用多抗吗？按道理单抗也应当出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加疏基乙醇变性后，每孔上样20微升提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？解答
1、建议您用恒压进展电泳，先用70V等跑过积层胶与分别胶的界限时，换用90-100V再跑3小时左右
2、转膜可用恒流，但要依据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，
0.8-
3.0mA/CM2分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2蛋白的分子量是80KD那么你就可以以
2.0mA/CM2的条件进展，你就可以60mA的电流进展
3、我觉得你的抗体应当没问题
4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们试验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度TTT.目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT-PCR就显示细胞中mRNA表达不高，估量将培育上清冻干浓缩后承受WesternBlot还可能检测不出，但假设用western是否肯定要用
0.2贝”的膜？用Tris-tricineSDS・电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分别胶用40%T丙稀酰胺（
2.6%C）浓度为
16.5%另外两层都用30%丙稀酰胺，中间一层浓度为10%枳层胶浓度为4%凝胶厚度1mm转膜的条件试过30V70分钟膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎见到目的条带，上样量为60pg细胞胞浆总蛋白，转膜的条件怎么样适宜？解答肯定要用
0.2pm的膜，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Western不好做，要依据你的试验曙材来定，一般你要是有prestainedmarker就可以参照一下，假设相应的分子量大小的marker转移的好就可以了UUU.怎样才能把胶跑的格外秀丽，泳道和band都能很直，是不是上样的量很束要，窿胶有什么技巧吗？想跑秀丽，是不是应领先小电压，再高电压，总体上电压小些会跑的好些还有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带秀丽些？解答影响跑胶跑的质量，有以下几个因素I、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥电压越小，条带越秀丽，浓缩胶80v分别胶100v就能跑得很好
2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分别越均匀倒胶之前，肯定要充分混匀，玻璃板肯定要干净，双蒸水隔离时，肯定要比较轻地加上去，避开稀释上层的分别胶，使胶不均匀VVV.为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丧失一些哪什么缘由？解答小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一局部小分子的就透过去了上次转染了
1.6*106细胞，收集，收集到了400微升体积，加6*loadingbuffer95度煮5分钟，-20度，交替3次，离心，上样，7%分别胶，先80V跑进分别胶，在I00v电泳至旗酚兰出胶，biorad半干转PDVF膜，I5v转30分钟，预染marker全部进膜，转移后的胶考马斯亮兰染，nJ■见残留的蛋，大分子量多些.blol时，封闭用5%奶粉TTBS1小时抗体稀释液TTBS一抗（1:10单抗上清，2023年制备）1小时二抗（1:2023）1小时，均在室温.结果，50kd的小分子显色，I6（）kd大分子未显色缘山分析及预备改进转染大容量的质粒（融合蛋白的质粒）的效率会相对较低，大分子量表达也会相对较低，加上大分子量蛋白的转移不完全，可能是我没有拿到大分子量条带结果的缘由另外背景略微有一些脏（背景整体均匀全都），估量是二抗的浓度高了些，预备降至1:5000另外抗体稀释液预备改用5%奶粉TTBS封闭改为室温2小时这个过程有没有问题？解答苜先分析你的整个试验步骤我觉察了两个比较大的毛病
1、一抗用TBST稀释依据我的理解，一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相全都，这样可以降低背景
2、“biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟“，你是这么做的吗？由于我大局部时间是做的恒流转移，用的是
0.1】“加膜，100101-2001^转2小时到最终电压会升到20V左右你用恒压法，我不是很确定你转30分钟能将大分子（160kd）的抗原转上去我建议你最好能将时间延长，假设是恒流，可按我的做法；假设是恒压，可摸索一下，适当延长时间有时候你的marker也有可能哄骗你，由于marker的量比较大，是很简洁转上去的，实际上目标蛋白的量远远少于marker量我对你的结果分析如下
1、你的结果很好，估量离目标不远了，很快就可以成功
2、没有160kd的带是由于你的转移时间过短，适当延长转移时间（我疑心这是主要的问题）
3、你的一抗用1102抗可以降到15000背景会低一点
10.方法的介绍XXX.我想将hbx转到hepg2细胞里通过检测hbx蛋白的水平来检验转染的效率不知道可不行行？解答WesternBlot检测HBX蛋白的表达来检测转染效率不是一个好方法，建议还是
1、最好是带有荧光标签的HBX转染来看转染效率，最牢靠
2、其次，HBX和荧光载体共转染，相对说明问题
3、荧光载体单独转染，主要是看细胞好不好转了呵呵转染效率凹凸荧光显微镜下一目了然了有的细胞荧光强，有的细胞荧光弱，有的没有所以HBX表达强很可能是少数细胞荧光强的结果，不代表转染效率YYY.半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小似乎都有关系，那么湿法转移是不是全部的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？解答半干转的电流大小是依据面积来算的，时间是依据蛋白分子大小定的而湿转的话电流是恒定的，时间也是依据分子量而定ZZZ.转膜时何为湿法，何为半干法？解答半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法AAAA.为什么浓缩胶和分别胶的电压不全都？同样的电压可以吗？解答浓缩胶的目的使得loading的样品能够在同•条水平线上进入分别胶，假设电压太大前端的蛋白简洁在后面的蛋白赶上来前进入分别胶而在分别是理论上（实际上也是）小电压长时间分别的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑BBBB.假设目的蛋白比较小，21和38kd转膜时（Biorad的湿转仪）时间是否能缩短些？100伏电压，甲醉的量是否也可以相应增加？解答假设是小蛋白可以用小电压28V—36V4-6hours（4度）甲醇10%—20%就可以了DDDD.显色目的条带又细又浅，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD的c-myc应当是高表达每个涌道上50-70〃g蛋白，开头用半干转移，后来用湿转14v16h用PVDF膜转移胶转移后染色检测，觉察小分子量的根本转移走了，可是为什么条带老是不粗不浓呢？解答可能跟你的一抗有关系，还有应当高表达，那实际做的阳性比照是否是高表达还有跟抗原量相关你多上点蛋白会好的多；跟显色条件相关EEEE.背景很花，固然条带也很淡，假设我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法识别，但有时条带又很明显，背底很淡解答这跟你washing的时间和强度有关，很可能你在这方面没有把握好显影时间是有范围的，久了确定不行FFFF.纯化过的目的带包括其上下都消灭了色带，而且比照菌也消灭了条带，会是什么缘由？解答一抗有问题，效价太低，且未纯化表达量太低提蛋白时可能出了问题GGGG.做WesternBlot的检测的时候，用DAB显色还能看出条带，但站换成ECL的时候什么样结果都没有我用的NOVA公司的发光底物，胶片是一般的X片，定影液和显影液都是别人留下来的，不知道是什么缘由？解答一般的说，氏1比DAB更灵敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有几种可能ECL底物失活了，你可以检测一下；敏感度正好不到EC1底物的范围DAB能显色可不能催化ECL底物；显影液没用了HHHH.怎样分析结果，需要什么软件？解答假设你做定量或办定量，至少要用到一个光密度扫描分析软件，假设不是，直接分析就可以IHI.积层胶、分别胶一般多少左右适宜？解答:一般电泳是枳层胶60-80v分别胶100v.JJJJ.承受生物素标记的二抗一SABCDAB检测系统做western非特异性的条带和背景高？总蛋白考染的时候觉察接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在•起了，这是什么缘由，如何解决？sds-的时候恒压和恒流哪个好？解答非特异性的条带和背景高可能性太多了，一抗，二抗，封闭的缘由都可能总蛋白考染的时候觉察接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越卷下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么缘由，如何解决？正常的，另外，是否是你的积层胶有问题Sds-的时候，恒压和恒流都可以用KKKK.血清样品进展WesternBlot分析，目的蛋白21kD结果显色出来后目的条带很淡而白蛋白和IgG条带很浓？解答可能是由于白蛋白为67kD和目的蛋白相差教大，且他的浓度较低，你可以以底物二氨基联苯胺和
0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟，再用去离子水漂洗以终止反响;也可能是抗体的特异性不好把封闭的时间延长，同时提高封闭液的浓度，可以削减以下背景噪音同时洗的时候要彻底，而目的条带弱，说明浓度缺乏，假设不考虑后续功能的话，你可以过G-50（细）柱子，纯化你的靶蛋白，接着真空冷冻浓缩，可以得到很秀丽的结果LLLL.Wesiem转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带（正常应当有6条），其余各泳道均有清楚的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果一样经5%的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进展一抗孵育（1200建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时
（12023）均在室温卜.DAB显色，虽消灭蛋白条带，但较弱且消灭非特异性条带请问
1、Marker是MBI公司的可分别14-116KD的蛋白，买了或许有一年的时间，是否有问题？
2、一抗（为多克隆抗体）、二抗的浓度及孵育的时间是否适宜？
3、封闭的时间是否太短？解答
1.marker有可能被降解.了，也有可能是它标称的上样量太少，不够，我做过一个标称每次5ul可我上了20ul才行的.建议，一抗4度过夜也很好，建议1:100室温2hrs就够了，.二抗室温1小时，1:2023我宠爱4度封闭过夜（室温2hr就够了），1抗室温Ihr2抗室温Ihr最好是一抗4度过夜（或室温2小时）1:2002抗室温1小时】:2023换ECL法/Pp再上样，一般为20-25uL总蛋白量100|igo
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:3O.3gTris188g甘氨酸，lOgSDS用蒸储水溶貂至1000ml得
0.25mol/LTris-
1.92moi/L甘获限电极缓冲液临用前稀释10倍
8、转移缓冲液配制1L转移缓冲液，需称取
2.9g甘氨酸、
5.8gTris碱、
0.37gSDS并参加200ml甲醇加水至总量1L
9、丽春红染液储存液丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液使用后应予以废弃
10、脱脂奶粉5%w/vII、NaN
30.02%登氮钠有毒，戴手套操作，溶于磷酸缓冲盐溶液PBS
12、Tris缓冲盐溶液TBS:20mmol/LTris/HCLpH
7.5500mmol/LnaCIo
13、Tween2015鼠抗人-MMP-916鼠抗人-TIMP-
114、过氧化物酶标记的其次抗体
15、NBT溶于70%:甲基甲酰胺，75mg/ml
16、BC【P溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml
17、100mmol/LTris-HCLpH
9.5o
18、lOOmmol/LNaCL
19、50mmol/I-Tris-HCLpH
7.55mmol/LEDTAo可以参看分子克隆
四、主要步骤主要包括以下4个根本步躲
1.样品制备原始样品可为细胞、组织、培育上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献.培育细胞或药物处理.弃培育基，用IXPBS漂洗细胞2次，去尽残留培育基.参加IXSDS样品缓冲液6-wcllplalc100葡/w或75cm2plaic500-1000瓶，刮落细胞，转移至ijEp管留意冰上操作.超声10-15秒剪切DNA以减低样品粘性.煮沸样品5minuteso.离心12023g5min取上清.电泳分别上样15W〜20m至SDS-胶lOcmx10cm电泳如要定量检测某蛋白的表达水平，应用R1PA裂解液Imlper107cells/100mmdish/150cm2flask裂解细胞，收集裂解液至离心管中在振荡器上混匀4~15min14000g离心15min4C弃沉淀用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进展Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actino留意一般上样20〜30明已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至lOOpg但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或承受更敏感的检测方法.电泳分别参照SDS-电泳方法.转膜杂交膜的选择是打算Westernblot成败的重要环节应依据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素选择适宜材质、孔径和规格的杂交膜用于Westernblot的膜主要有两种硝酸纤维素膜N和PVDF膜NC膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境卜♦大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在•起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来依据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜由于随着膜孔径的不断减小，膜对•低分子量蛋白的结合就越结实通常用
0.45pm和
0.2Mm两种规格的NC膜大于20kD的蛋白可用
0.45pm的膜，小于20kD的蛋白就要用
0.2R的膜了，如用
0.45囚”的膜就会发生“Blowthrough”的现象PVDF膜灵敏度、区分率和蛋白亲和力比常规的膜要高，格外适合于低分子量蛋白的检测.但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟蛋白质常用的转移方法主要有两种槽式湿转和半干转移前者操作简洁，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少以下为槽式湿转的操作步骤将胶浸于转移缓冲液中平衡lOmin留意如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白筒洁集中出胶依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡lOmin如用PVDF膜需用纯甲醉浸泡饱和3-5秒钟装配转移三明治海绵3层漉纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡切记胶放于负极面（黑色面）将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，1OOVlh（电流约为O.3A）留意应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通转膜完毕后，切断电源，取出杂交膜
4.免疫杂交与显色.用25mlTBS洗膜5min室温，摇动.置膜于25ml封闭缓冲液中lh室温，摇动.15mlTBS/T洗3次（5min/T）».参加适宜稀释度的一抗，室温孵育l-2h或4（2过夜，缓慢摇动.15mlTBS/T洗3次（5min/T）..参加适宜稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育lh缓慢摇动.l5mlTBS/T洗3次（5min/T）..15mlTBS洗1次.蛋白检测（显色法或发光法，按相应试剂说明操作）留意事项:.操作中戴手套，不要用手触膜.PVDF膜在甲砰中浸泡时间不要超过5秒.如检测小于20kD的蛋白应用
0.2pm的膜，并可省略转移时的平衡步骤.某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用
1.0%BSA代替Tween-
20.关于封闭剂的选择5%脱脂奶/TBSorPBS:能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合力量O.3~3%BSAinPBS低的内源性穿插反响性.如用
0.1%Tween
20、
0.02%NaN3inPBSorTBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进展蛋白染色如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分别蛋白
五、试验常见的问题指南依据问题的类型主要分成以卜几类（以卜.资料权作参考，请勿盲目仿照！）.参考书推举A.对初学者看什么资料比较好？解答:《抗体技术试验指南》和Antibodiesalaboratorymanual.wrotebyEdHarlowdavidlane）两本书不错.针对样品的常见问题B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot）提取线粒体后冻存（未加蛋白陋抑制剂），用的博士德的一抗，开头还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120gg换了个saniacloz的一抗仍不行是什么缘由？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答疑心是样品问题，可能是1样品不能反复冻融；2样品未加蛋白地抑制剂同时，建议检查WesiemBlol过程，提高一抗浓度对于加蛋白酷抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白的抑制剂E.同一蛋白样品能同时进展两种因子的WesicrnBlol检测吗？解答固然可以，有的甚至可以同时测几十种样品F.假设目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要留意什么？解答假设是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温顺得多，这时最好加上NaF去抑制璘酸化酶的活性G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时常常会觉察只有一局部蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶觉察有的孔全部的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么方法可以解决？解答你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用削减电流延长时间，多加5—10%甲醇H.想分别的蛋白是分子量260kd的，SDS-电泳的分别胶浓度多大适宜？积层胶的浓度乂该用多少？这么大分子量的蛋白简洁作WeslernBlot吗？解答260kd的蛋白不好做，分别胶用6%StackingGel
3.5%»I.假设上样量超载，要用什么方法来增加上样量？假设需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚解答可以浓缩样品，也可以依据你的目标分子量透析掉一局部小分子蛋白一般地，超载30%是不会有问题的假设已经超了不少了，而旦小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试
1.5mm的combJ.蛋白变性后可以存放多久？解答一8（TC一两年没有问题最关键两条不要被蛋白酶水解掉不要被细菌消化掉（也於被酶水解了）K.我所测定的蛋白分子量是105KD.按理说分别胶应当承受
7.5%但我所查资料却要求分别股和浓缩胶均承受11%的配方，不知为何？解答上述您提到的两种凝胶均可以使用，由于105KD的蛋白在上述两种胶的线性区分范围内，但需留意条带位置L.接下来我预备承受DAB显色技术，抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知承受这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？似乎有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答不能使用脱脂奶粉，由于脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应当好一点.M.还有•问题，・殷・次卜・样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答WesternBlot一般上样30—100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关开头摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，固然背景也就出来广要拿到好的结果，假设抗体好的话比较简洁，抗体不好的话就需要反复地试了，固然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行所以拿到好的结果不简洁N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答必需进展研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更猛烈的方法抽提，低十度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）还有一点就是组织中的蛋白朝活性更强，需要留意抑制蛋白醉的活性（参加PMSF和蛋白酹抑制剂cocklail）封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用假设一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD在做western要留意什么呢？解答做200kd蛋白的WesternBiol时要留意，分别胶最好选择＞7%的；剥胶时要留神；转移时间需要相应延长要做分子量参照（否则消灭杂带不知道如何分析）P.有什么方法可以提高上样量？解答可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量Q.我要检测的目的蛋白是分子量或许为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不行以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffcr提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBloi就可以了假设是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机42kd不算大，也不算小，所以，可以依据一般的转移方法实施R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答上样量要依据试验的要求来定，假设要求是定量和半定量的WeslernBlot则上样量要均等，假设只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过
0.3〃g/mm2S.一抗，二抗的比例是否重要？解答比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掠局部非特异的本底
3.抗体做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot其二抗有何要求？解答对二抗无要求，要看你试验条件来选择，•股推举用HRP标记的二抗U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕贽时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，假设封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了解答不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最正确的抗体稀释度也是不一样的，需要你试验摸索我觉得转膜过夜似乎没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必铺张时间呢至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式•抗固然可以过夜，假设你想所短WeslernBlot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们试验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗11500二抗120230试试另外建议你洗膜时，多洗儿次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min跑一张好膜不简洁，多尽点心吧，这样不会铺张你的时间，只会审约你的时间！V.免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？解答免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原打算簇1又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，自然蛋白和煮后的蛋白都含有构象型表位由于受蛋白空间构造限制，煮后变性会消逝假设你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western而假设抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化一股抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间（限于单抗）。
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