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琼脂糖凝胶电泳原理L琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是它兼有“分子筛和电泳的双重作用琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中蛋白质和核酸会根据不同带有不同电荷,在电场中受力大小不同,因此跑的速度不pH同,根据这个原理可将其分开电泳缓冲液的在之间,离子强度为最适pH6~
90.02~
0.05常用的琼脂糖作为电泳支持物琼脂糖凝胶约可区分相差的片段,其分辨率1%100bp DNA虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广普通琼脂糖凝胶分离的范围为DNA,利用脉冲电泳,可分离高达人的片段
0.2-20kb107bp DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应分子在高于等电点的DNA DNA溶液中带负电荷,在电场中向正极移动由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数pH量的双链几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动DNA操作流程2准备干净的配胶板和电泳槽具有与原核生物核糖体大亚基中的相似的结构决定功能,可作为16S rRNA23S rRNA核糖体蛋白质结合的架构在足量存在下分离到的处于紧密状态,其空间Mg2+16S rRNA结构与亚基的大小和形状十分相似30S的端含有能与上游起始密码子通过氢键结合的反夏因-达尔加16S rRNA3mRNA AUG诺序列另有发现表明,中的序列与的相应序列有16S rRNA1,505-1,539CCUCC mRNA互补关系能通过氢键与结合,增强原核生物核糖体一大一小两个亚基16S rRNA23S rRNA70S亚基与亚基结合时的稳定性50S30S能通过其及的腺瞟聆残基参见瞟吟分子结构图解的原子与16S rRNA1,4921,493N1骨架上的基团之间产生氢键,使核糖体位密码子-反密码子的碱基互补配对mRNA21OH A稳定化.通用前体2由于不同种的真细菌与古细菌间的基因是高度保守的,16s rRNA16s rDNA16s rDNA常被用于对各种生物进行的系统发育学方面的研究这种运用对生物进行系统发育16S rRNA学研究的方法由卡尔沃斯开创另外,线粒体和叶绿体中的也都被扩增•Carl WoeserRNA了在获得能提供系统发育学信息的分子时需要利用通用引物对16s rRNAPCR16S rRNA分子进行扩增序列的对比分析需要在这类“通用引物的脱氧核糖核酸分子的辅16s rRNA助下完成,这类分子具有如下序列正向8UA5-AGA GTTTGA TCMTGG CTCAG-3反向:519B5-GTA TTACCG CGGCKG CTG-3反向:ACG GCTACC TTGTTA CGACTT这类引物因并未在近期发现的几种属于纳古菌门的热液古菌中分离识Nanoarchaeota别出来,也被称为准通用引物.进化指征3在众多的生物大分子中最适合于提示各类生物亲缘关系的是尤其是被rRNA,16s rRNA普遍认为是一把好的谱系的分子尺这是因为参与生物蛋白质的合成过程,其功能是任何生物都必不可少的,而且在生1rRNA物进化的漫长经历中其可能保持不变在分子中,既含有高度保守的序列区域又有中度保守和高度变化的序116S rRNA列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物相对分子质量大小适中,便于分析在、和316S rRNA5S rRNA23S rRNA16S rRNA三种分子中,包含个核甘酸,虽然它也可以作为一种信息分子加以利用,但5S rRNA120由于其信息量小应用上受到限制蕴含着大量的信息,但序列测量和分析比较的23S rRNA工作量较大而相对分子质量大小适中约含个核甘酸含有比较广泛的的16S rRNA1540生物信息量,加上在细胞中含量大约占细胞中的也易于提取rRNA RNA90%普遍存着于真核生物和原核生物中,真核生物中其同源分子是416S rRNA18SrRNAo读书的好处、行万里路,读万卷书
1、书山有路勤为径,学海无涯苦作舟
2、读书破万卷,下笔如有神
34、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的达尔文、少壮不努力,老大徒悲伤
5、黑发不知勤学早,白首方悔读书迟——颜真卿
6、宝剑锋从磨砺出,梅花香自苦寒来
7、读书要三到心到、眼到、口到
8、玉不琢、不成器,人不学、不知义
9、一日无书,百事荒废——陈寿
10、书是人类进步的阶梯n、一日不读口生,一日不写手生
12、我扑在书上,就像饥饿的人扑在面包上——高尔基、书到用时方恨少、1314事非经过不知难——陆游、读一本好书,就如同和一个高尚的人在交谈——歌德
15、读一切好书,就是和许多高尚的人谈话——笛卡儿
16、学习永远不晚——高尔基
17、少而好学,如日出之阳;壮而好学,如日中之光;志而好学,如炳烛之光18-刘向、学而不思则惘,思而不学则殆——孔子
19、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干——培根20琼脂糖凝胶电泳水平电泳注意酶污染的仪器可能会降解,造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象DNA DNA电泳方法Q一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以;如果需要分辨率高的电泳,特别是只有几个的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳;用普通电泳不合适的巨大链应该使用脉bp DNA冲凝胶电泳注意巨大的链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带DNA凝胶浓度2对于琼脂糖凝胶电泳,浓度通常在
0.5〜2%之间,低浓度的用来进行大片段核酸的电泳,高浓度的用来进行小片段分析低浓度胶易碎,小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法注意高浓度的胶可能使分子大小相近的带不易分辨,造成条带缺失现象DNA缓冲液3常用的缓冲液有和而比有着更好的缓冲能力电泳时使用新制的TAE TBE,TBE TAE缓冲液可以明显提高电泳效果注意电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低值上升,,pH缓冲性能下降,可能使电泳产生条带模糊和不规则的带迁移的现象DNA DNA三羟甲基氨基甲烷一般简称为是一种有机Trishydroxymethylaminomethane,Tris化合物,其分子式为被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的HOCH23CNH2Tris缓冲液的制备例如,在生物化学实验中常用的和缓冲液用于核酸的溶解都需TAE TBE要用到Tris电压和温度4电泳时电压不应该超过电泳温度应该低于℃,对于巨大的电泳,温度20V/cm,30DNA应该低于匚注意如果电泳时电压和温度过高,可能导致出现条带模糊和不规则的15DNA带迁移的现象特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象样品的纯度和状态5DNA注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象乙醇沉淀可以去除多余的盐,用酚可以去除蛋白注意变性的样品可能导致条带模糊和缺失,DNA也可能出现不规则的条带迁移在上样前不要对样品加热,用缓冲DNA DNA20mM NaCI液稀释可以防止变性DNA的上样6DNA正确的上样量是条带清晰的保证注意太多的上样量可能导致带型模DNA DNA DNA糊,而太小的上样量则导致带信号弱甚至缺失DNA⑺的选择Marker电泳一定要使用或已知大小的正对照来估计片段大小DNADNA Marker DNADNA应该选择在目标片段大小附近较密的,这样对目标片段大小的估计才比较准Marker ladder确需要注意的是的电泳同样也要符合电泳的操作标准如果选择Marker DNAADNA/Hindlll或者的酶切需要预先℃加热冰上冷却后使用从而避免ADNA/EcoRI Marker,655min,或酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象HindHI EcoRI概述DL2000DNAMarker是由单独的PCR扩增产物混合而成,已含有IxLoadingBuffer,可以直接电泳包括6条双链DNA片断1OObpx250bp、500bpxDL2000DNAMarker750bp、1OOObp和2000bp每次上样4~5NL—2000bp目录号包装价格—lOOObp—750bp50次PBZ0305-
175.00—500bp0次PBZ0305-
2120.00—250bp—lOObp⑻凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是澳化乙锭,染色效果好,操作方便,但是稳定性差,具EB有毒性注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长,如果激发波长不对,条带则不易观察,出现条带模糊的现象回收编辑3片段的胶回收方法lDNA电泳洗脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法胶回收注意事项
2.将电泳槽用反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液;a ddH20根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板;b.切胶时尽可能切掉不含片段的凝胶;c.DNA.要尽量减少在紫外下的照射时间以减少对的损伤;d DNADNA熔胶要完全e.loading buffer的中文名字叫上样缓冲液,的缓冲液中可以显示两条带,前面的紫兰色loading buffer6*的条带是浸酚蓝,在、、和琼脂糖凝胶电泳中,漠酚兰的迁移率分别与、
0.6%1%
1.4%2%1Kb、和的双链线性片段大致相同;后面的兰色条带是二甲苯青,它在
0.6Kb
0.2Kb
0.15Kb DNA和琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与和的双链线1%
1.4%2Kb
1.6Kb性大致相似而对于胶他们的迁移速率也分别不同DNA PAGE.主要用途1的功能主要有两个loading buffer第一,里边的指示剂漠酚蓝和二甲苯青起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们FF适时终止电泳;第二,里边的成分甘油可以加大样品密度,使样品密度大于,从而沉降到点样孔中,TAE防止样品飘出点样孔另外,有的是加有的,一般都会写明主要是促使聚合酶变性,因为Buffer SDSSDS没有除尽的聚合酶会结合在双链上影响它的迁移速率细胞裂解后的裂解液,加DNA loading℃加热,也是为了中止酶促反应,防止提取的蛋白质降解
100.制备方法2一般配置:loading buffer16xLoading buffer:30mM EDTA36%v/v Glycerol
0.05%w/v XyleneCyanol FF
0.05%w/v Bromophenol Blue主要用于电泳DNA2lOxLoading buffer:30mM EDTA50%v/v Glycerol
0.25%w/v XyleneCyanol FF
0.25%w/v Bromophenol Blue主要用于电泳RNA注中仅有色素浸酚蓝一种染料浓度110xloading bufferBromophenol Blue
0.05%;中含色素溪酚蓝二甲苯青蓝26xloading bufferBromophenolBlue.FF Xylene两种染料浓度都是Cyanol FF
0.05%在琼脂糖凝胶中漠酚蓝约与的双链线状
0.5%~
1.4%BromophenolBlue300bp的迁移速度相同,二甲苯睛蓝则与的双链线状的迁移速度相DNA FF4kbp DNA等是用来上样的;是是停止酶促反应6xloading bufferlOxIoading bufferstop bufferf的,如果一定要用的上样当然也可以,唯一要注意的是lOxIoading bufferlOxIoading buffer中多了一样,它会使酶类如酶变性,以产物为例,在电泳泳道上会产生一片SDS taqPCR弥散,如果电泳跑的距离短,和多出来一条带没有什么区别大概左右lOOObp配制方法35xSDS-PAGE LoadingBuffer组份浓度250mM Tris-HCIpH
6.810%W/VSDS
0.5%W/VBPB甘油50%V/V如筑基乙醇5%W/V配制量5mL配制方法.量取下列试剂,置于塑料离心管中110mLIM Tris-HCI
1.25mL(十二烷基硫酸钠)SDS
0.5g(漠酚蓝)BPB25mg甘油
2.5mL.加入去离子水溶解后定容至25mLo.小份(份)分装后,于室温保存35003/.使用前将的加到每小份中425pl2-ME.加入的可在室温下保存一个月左右52-ME LoadingBuffer核糖体16S RNA.简介1核糖体(,或简称为)是[]分16S RNA16S ribosomalRNA16S rRNA116S rRNA的长度约为一个细菌的细胞中可包含多种具有不同序列的L542nt16S rRNA0已知具有如下几项功能:16s rRNA。