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细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
一、简介随着研究的进展,仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析ELIspot limitingdilution和单细胞应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及analysis,LDA PCR,表达可以识别和细胞,此方法可获得较强的细胞内信号,但此方法工作量大、mRNA Th1Th2主观性强,难以进行大样本检测,且人肉眼识别能力有很大的局限性,而及单细胞ELISPOT技术,技术性强、劳动强度大,难以进行广泛推广随着多标记及胞内细胞因子标记流PCR式细胞技术的出现,使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活尽管研究应用淋T巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成,如与TH1IL—2,IFN—y TH2IL—4,IL—5,IL—10,但这些研究很难外推,因为细胞克隆与体内细胞功能相关性还未被揭示T T近来,与采用了、等药物预孵,用、阻Jung Pickermonensin PMABrefeldinBFA Monensin断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集,蓄积,增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测因为自然状态下,淋巴细胞产生少量的细胞因子,通常要对淋巴细胞体外活化T T进行研究在体外刺激过程中,淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来,胞内细胞因子信号较T弱,难以进行检测这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子,并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在型与型分化,且这些分化在12特定细胞因子增强时可被逆转且这些研究清楚地证明,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞、、不能分泌细胞因子T BNK胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学与抗体选择,确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景具有其它方法难以比拟的优点洗胞再胞内染色荧光单抗不纯或荧光与抗体结使用试剂阻断Fc受体可以有效使用RD试剂减少非特异荧光染色,详见Fc段合不牢导致解析出的荧光染料受体阻断节非特异结合背景染抗体与固定后的胞内抗原亲和使用RD试剂并按推荐剂色太高力低,需提高抗体浓度量错误的同型对照,对照1g浓度按RD推荐量使用RD匹过高配的同型对照试剂严重的固定通透的细胞离心500g固定后细胞密度低于活细胞,需洗涤离心步骤丢失细胞细胞损用高转速离心失加样步骤丢失细胞弃上清带走细胞小心吸样按操作步骤用FL3做阈值PMA可稳定红细胞膜,PMA+I激活PMA+Ionomycin激活溶血不去除碎片和未溶细胞全血较难溶完全溶血未在室温进行在室温进行溶血Th1/Th2细胞研究方法尽管目前提出了较多的细胞表面标志,但根据淋巴细胞因子谱的异同识别和Th1/Th2Th1Th2细胞仍然是目前最有效的手段,特别是细胞内因子标记的流式细胞技术近来由于细胞因子试剂盒的不断涌现,为研究细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定ELISA Th1/Th2方法但研究淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将淋巴细胞特异克隆最近发现,在外CD4+T周血白细胞中,除淋巴细胞外,细胞也存在和样细胞因子谱的变化,甚至CD4CD8Th1Th2酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力,如酸性粒细胞可分泌、、、、IL-4IL-5IL-1IL-
6、、等因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别和细胞IL-8TNF TGFTh1Th2根据辅助淋巴细胞分泌的细胞因子谱的不同,将细胞分为T CD4cytokine profilesCD4Th1和亚群细胞主要分泌丫-干扰素、白细胞介素-和肿瘤坏死因子Th2Th1IFN-Y2IL-2・介导细胞免疫应答;而细胞主要分泌、、及等因子,促进抗BTNFf,Th2IL-4IL-5IL-10IL-13体的产生,介导体液免疫反应在多数免疫反应中,辅助淋巴细胞并不产生典型的或T Th1Th2细胞和相应的细胞因子,而主要是由细胞分泌的混合型的细胞因子但在疾病的状态下,ThO细胞受特异抗原的刺激时,一方面向方向发展,另一方面可能向方向发展如在ThO Th1Th2结核感染转状态下可产生和双向免疫反应,在型超敏反应疾病时主要产生以Th1Th2I Th2为主的免疫反应近几年来研究发现,平衡失调参与多种疾病过程,如肿瘤免疫、移Th1/Th2植免疫及变态反应等,而用流式细胞仪进行的检测克服了传统方法所得结果为整个群Th1/Th2体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足,通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群一般用或作表面标记,选择相应的荧光标的CD3+/CD4+CD3+/CD抗体,和细胞分泌细胞因子的情况如下Th1Th2Cytokine Thelper1cells Thelper2cellsIL-2IFN-TTNF-TNFFIL-4L-5;方法,AT IQP-367cwnrc正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值一批健康志愿者的全血用刺激小时后,按照操作程序测得参考值如下:PMA+lonomycin5细胞因子阳性细胞(均数%)阳性细胞(范围%)IL-
235.
525.0-
41.5IL-
41.
60.7-
2.2IFN-y
24.
918.0-
31.7TNF-a
23.
313.6-
35.9快速流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成,实验流程需小时,实际操作6・8时间为小时,快速简便;1-2简便无需组织培养,可以全血分析,无需分离PBMCs;灵敏度高高度灵敏的荧光标记与检测系统;高效可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型,进行多参数相关分析;安全减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况
二、所需仪器.流式上样管及细胞培养皿或板1孵箱
2.25%CO2,37℃3混匀振荡器.
4.离心机5加样器、.Tips6,流式细胞仪
三、常用的标本类型和处理方法全血使用肝素钠抗凝的真空采血管采血,不易采用肝素锂、和抗凝剂,血样在EDTA ACD8小时内分析,超过小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少如不能在85%8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置自身血浆中外周血单个核细胞PBMCs使用肝素钠抗凝的采血后,分离小时内分PBMCs,24析组织培养基中的外周血单个核细胞PBMCs用分离将细胞重悬于含热灭活Ficoll PBMCs,10%胎牛血清的培养基中,调节细胞浓度为细胞加|FBS RPMI—16402X16细胞系与T细胞克隆调节细胞浓度义细胞于新鲜培养基中2106/mL冰冻全血与PBMCs使用义红细胞裂解液处理活化的外周血或者用漂洗,并用1PBMCs,PBS含的及的的重悬,一冻存溶化后细胞置于染色管中,加上1%BSA10%DMSO PBS70℃的洗液,离心分钟后,用破膜剂对细胞进行破膜和染色2〜3mL5
四、所需试剂、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂1依据实验需要选择特殊表面标志圈定所有淋巴细胞CD45圈定淋巴细胞CD3T圈定辅助淋巴细胞亚群CD4T圈定抑制淋巴细胞亚群CD8T/或圈定淋巴细胞CD19CD20B圈定淋巴细胞CD56NK圈定单核细胞CD
14、荧光标记的细胞因子抗体提供、和标记的细胞因子抗体2RD FITCPE APC、溶血素用外周全血检测时需使用溶血素目录号用于人或者3RD WL1000WL2000用于小鼠;目录号溶解红细胞eBioscience00-
4333、激活剂4目录号
①Phorbol12-Myristate13AcetatePMA Alexis,ALX-445-004-M001中调节浓度A.DMSO
0.1mg/mL分装储存勿反复冻融B.20piL,—20℃每次实验用无菌无叠氮钠稀释储存液C.PBS1100终浓度细胞悬液D.PMA25ng/mL目录号2lonomycin Alexis,ALX-450-006-M001于乙醇中配制成浓度A.
0.5mg/mL一储存B.20C每次实验用无菌无叠氮钠稀释储存液C.PBS110终浓度细胞悬液D.lonomycin1pig/mL3Staphylococcal enterotoxinBSEB Sigma,Catalog No.S-4881无菌无叠氮钠调节浓度A.PBS
0.5mg/mL储存B.4℃终浓度细胞悬液C.SEB10ng/mL包被在培养板中,在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞4CD3加速不同刺激剂包括、等的活化效应,浓度一般为5CD28SEB CD310ug/ml、阻断剂5阻断高尔基体介导的转运作用,使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内目录号
①Brefeldin-ABFA eBioscience,00・4506于中调节浓度A.DMSO5mg/mL分装田,储存勿反复冻融B.20-20c每次实验用无菌无叠氮钠稀释储存液C.PBS11激活最后小时终浓度细胞悬液D.4-5BFA10|ig/mL注意过度孵育会导致细胞活力下降BFA目录号
②Monensin(eBioscience,00-4505)、不含谷氨酰胺的6RPMI-
1640、固定剂细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定固定的目的在于通过蛋白的交联和变性7一方面使细胞因子固定在细胞内,另一方面避免细胞表面抗原丢失含的多聚甲醛溶4%PBS液目录号(eBioscience,00-8222)、破膜剂含%皂玳、叠氮化钠的溶液目录号
810.05%Hanks(HBBS)(eBioscience,00-8333)将细胞膜穿孔,已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内,于相应的细胞因子结合、其它试剂无菌无叠氮钠乙醇,含多聚甲醛的储存9PBS,1%PBS,4c
五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子,根据检测指标和标本的不同,研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间,以获得最佳的实验结果下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法表、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法1检测细胞因子阳性对照刺激方法人TFN-g方法2(4-24小时)人TIMP-1方法5人TNF-方法7(6小时)人IL_la方法3(6小时)人ILT方法3(24小时)人IL-2方法2(4-24小时)人IL-4方法4人IL-5方法1人IL-6单核细胞方法36-12小时T细胞方法6人IL-10方法1人IL-12方法8人IL-15方法3人Fractalkine/CX3CLl方法1人IL-8/CXCL8方法324小时人MCP-1/CCL2方法324小时人MIP-U/CCL3方法324小时人MIP-lb/CCL4方法324小时人RANTES/CCL5方法1小鼠IL-2方法9小鼠IL-4方法10小鼠IL-5方法10小鼠IL-6方法11小鼠IFN方法9or方法12小鼠TNF-方法9为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后个小时,需要使用蛋白转运抑制剂如4-6的3uM monensin,10mg/ml BFA方法只使用转染细胞检测1:方法人的使用和刺激小时.2:PBMCs PMA10ng/ml lonomycin1uM4-24方法人的使用刺激小时.3:PBMC LPS
0.5-1ug/ml24方法人的或者纯化的细胞在包被人抗体的培养板中,使用含有重组人的4:PBMCs CD4+CD3目录号和目录号的培养基培养两天;IL-210ng/ml,202・IL・010IL-410ng/ml,204-IL-005细胞洗涤后在含有重组人和的培养基中继续培养天;最后收获细胞,使用IL-2IL-42PMA10和刺激小时ng/ml lonomycin1uM6方法细胞使用刺激5:CD4+T PHA10ng/ml4days方法细胞使用抗的单抗、抗的单抗和重组人的6:T CD3CD28IL-1bLorre,Ea/.,1994,Clin ImmunoImmunopath70:1方法使用和刺激7:PMA50ng/ml lonomycin500ng/ml方法细胞使用重组人目录号刺激小时,然后使用8:PBMCs IFNy10ng/ml,285-IF-1002刺激小时或者使用相同的方法刺激细胞.IFNy10ng/ml+LPS1ug/ml22THP-1方法在包被抗小鼠抗体的培养板中,使用抗抗体9:EL4CD325ug/ml CD282ug/ml+PMA5刺激小时ng/ml+lonomycin500ng/ml6方法细胞在包被小鼠抗体的培养板中,使用含有抗小鼠的10:CD4+T CD325ug/ml CD282的抗体,重组小鼠的目录号和目录号ug/ml IL-210ng/ml,402-ML-020IL-4C50ng/ml,的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠和的培养基中继续培养天;404-ML-005IL-2IL-43最后收获细胞,使用、和刺激小时PMA5ng/ml lonomycin500ng/ml monensin6方法小鼠巨噬细胞使用刺激小时11:ip Mouseip1ug/ml LPS24方法方小鼠脾细胞使用和刺激小时PMA5ng/ml lonomycin500ng/ml6
六、流式检测细胞染色基本过程以全血为例、收获细胞肝素钠抗凝的静脉血,按与培养基混匀,加刺激剂,同时加蛋白转运抑111制剂参照说明书,混匀后,二氧化碳培养小时37℃,5%4-
6、阻断受体用于消除非特异性的结合染色2Fc
①在小鼠,可使用纯化的受体的抗体按照细胞的用量,在染色缓冲Fcll/lll CD16/32,1ug/106液中孵育分钟,清洗后,直接进行下一步染色4℃15PBS
②对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化或者血清进行lg阻断、细胞表面染色3
①加适当的细胞表面染色试剂于管中,加入迎激活后的全血(细胞浓度维20HL Falcon100持在混匀,室温暗处孵育分钟;2X106/mL)15
②加入溶血素,室温暗处孵育分钟(注意激活的全血可能会溶血不完全)10PMA
③离心分钟,弃上清500g
54、固定和破膜
①加固定剂,室温暗处孵育分钟,离心分钟,弃上清;15500g5
②加破膜剂温暗处孵育分钟(剂量参照说明/)10
③加洗液,离心分钟,弃上清2〜3mLpBS500g
5、细胞内染色5
①加入荧光标记的细胞因子抗体,混匀,室温暗处孵育分钟30
②力口洗液,离心分钟,弃上清,力口入上机或加入2〜3mL500g5500)LILPBS500|iL1%固定后再上机PFA
七、注意事项.标本处理避免使用络合钙的抗凝剂,如与因为它们会限制钙依赖性激活过程,1ACD EDTA,推荐用肝素钠此外一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会混淆试验结LPS,果血样在小时内分析,超过小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少885%如不能在小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置8,刺激激活检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间,以保证最佳的2检测效果比如,要检测则可选择和同时刺激;如果用做表面标IFN-Y PMAlonomycin CD4记,由于多数病人的抗原会因的激活而有不同程度的下调,所以培养时间不能太长,CD4PMA小时为宜,否则下调影响分析4・6CD
4.选择合适的对照为保证结合的真是和可靠性,至少荧光设置以下对照:3
①未刺激对照激活时由于的存在抑制了胞内蛋白的转运,因此在激活过程中产生的抗BFA原与细胞因子会滞留胞内,未刺激对照也应包含BFA
②激活对照激活对照使用细胞表面表达来评价激活与否,如果未达到期望的水CD69CD69平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染,需制备新鲜刺激剂重新实验
③同型对照使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色受体阻断使用试剂阻断受体可以有效减少非特异荧光染色,在小鼠可以用纯化的抗
4.Fc Fc小鼠的目录号在大鼠可以用纯化的抗大鼠的在CD16/32(eBioscience,14-0161-81),CD32,人可以用过量的同种无关纯化或血清lg荧光素的选择检测相对低表达细胞因子如时,应选用或标记;单检测某一
5.IL-4PE APC细胞因子时最好也选用或标记;同时检测多种细胞因子时,弱表达的应选用或PE APCPE APC,标记最好用于高表达细胞因子如FITC IFN-Y
八、问题与解答问题原因解决注释PMA+Ionomycin激活4小时后激活剂制备不当,见激活细胞未激活CD3+T淋巴细胞CD69阳性率剂制备储存一节应90%应使用肝素钠,不要使用无CD69淋巴细胞激活需要Ca,络合Ca的使用了错误的抗凝剂肝素锂,避免使用ACD与胞内染抗凝剂会影响激活EDTA等络合钙的抗凝剂色在使用通透液前先使用溶细胞未通透溶血素辅助细胞通透血素详见BFA制备BFA于BFA失活或制备不当详见BFA制备-20℃储存正常的激活T淋巴细胞IL-4表达胞内染按RD推荐量使用荧光抗抗细胞因子抗体浓度不对通常〈2%,应使用PE或APC标记色阳性体但很弱通透后细胞在胞内染色前未按操作程序通透后洗细。