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文本内容:
纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法
一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖,具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与试剂发生显色反DNS应反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比酶活定义纤维素酶活力单位是指℃的条件下,以每分钟催化竣甲基55pH
5.0s纤维素钠水解生成还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位lpmol U
二、实验试剂竣甲基纤维素钠(聚合度),内切纤维素酶(苏柯汉)1700-2000试齐」
三、实验仪器50mmol NaAC-HAC DNSIs容量瓶(、、)、1000ml*2500mlx3100ml50mlx4ml移液器、烧杯(、)、具塞试管、电热套、水浴锅、分500mlx350mlx3光光度计、计、电子天平pH
四、标准曲线的绘制管号0123156葡萄糖溶液(血)
00.
20.
40.
60.
81.
01.2蒸饰水(ml)
21.
81.
61.
11.
21.
00.8DNS2222222摇匀,沸水浴定容至向,测5min,25OD540nm0D540nm
五、酶活测定由于苏柯汉给定的范围为,故选用的pH
4.8-
5.2pH
5.050mmol缓冲液测定纤维素酶酶活NaAC-HAC、样品的制备1溶液的制备用的缓冲液CMC-Na pH
5.050mmol NaAC-HAC配置的(竣甲基纤维素钠)溶液,准确称量
0.5%CMC-Na CMC-Na精确至溶于蒸储水中,水浴锅中搅拌溶解,冷却后定
0.05g,
0.001g,45T容至100mlo纤维素酶液的制备准确称取纤维素酶,精确到用
0.001g50mmolo的缓冲液配置成适当的浓度倍,保证吸光度在NaAC-HAC pH
5.010000之间
0.2-
0.
6、法测酶活:2DNS取的溶液于具塞刻度试管中,℃预热
1.8ml
0.5%CMC-Na25ml55左右,加入适当稀释的酶液,于(水浴锅中保温lOmin
0.2ml5530min后,然后加混匀,沸水浴,冷却至室温,定容到2ml DNS,5min25ml混匀测OD540nm空白对照用酶活的酶液作对照、结果计算3纤维素酶活力()U/g=rxDfxl000/
180.2/t式中:通过值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓r OD540nm度():木糖的相对分子量,pg/ml;
180.2g/mol;:酶解反应时间,t min;:稀释倍数Df酶活力的计算值要保留三位有效数字苏柯汉公司给定的酶活计算公式为纤维素酶活力()U/g=rxDfx2xl000/V式中:通过值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的r OD540nm浓度()实验时移取的酶液体积,Mg/ml;V:
0.2ml;:时间换算,的倒数为230min2;:稀释倍数Df酶活力的计算值要保留三位有效数字
六、最适温度在最适的条件下,选择一系列温度梯度,分别在、、、、pH
30404550、、
5560、、V下按酶活测定方法测定酶活,确定最适温度6570
七、温度稳定性在最适条件下,将纤维素酶溶液在一系列温度梯度中保温前pH72h,每小时测一次酶活,每测一次,之后测一次看纤维6h6-10h2h12h素酶活变化纤维素酶的分离纯化
一、实验试剂、、NaAC HACNaCI
二、实验方法-纤维素酶的分离纯化、上样缓冲液的;梯度洗脱液为
10.05mol/L NaAC-HAC,PH
5.0含
0.1,
0.2,的梯度的上样缓冲液
1.0mol/L NaCI、将买的纤维素酶用缓冲液配成浓度的溶液21%、用倍床体积的上样缓冲液平衡柱子,流速上样
330.5mol/min,40mI,洗涤个柱体积后开始进行梯度洗脱,收集各组分2-
3、将各收集组分超滤脱盐,浓缩,是浓缩电导率在以下440uS/cm、真空冷冻干燥脱盐后的浓缩液经真空冷冻机干燥备用5
二、木聚糖酶纯度HPLC将分离纯化后的木聚糖酶经检测其组分、纯度HPLC醋酸-醋酸钠缓冲液取醋酸钠加冰醋酸再加水稀pH
3.
65.1g,20ml,释至即得250ml,醋酸-醋酸钠缓冲液取无水醋酸钠加水溶解后,pH
3.720g,300ml加浸酚蓝指示液1ml及冰醋酸60〜80ml,至溶液从蓝色转变为纯绿色,再加水稀释至即得1000ml,醋酸-醋酸钠缓冲液取醋酸钠溶液与醋pH
3.82mol/L13ml2mol/L酸溶液』口87ml每含铜的硫酸铜溶液再加水稀释至即1ml lmg
0.5ml,1000ml,得醋酸-醋酸钠缓冲液取醋酸钠加冰醋酸再加水稀pH
4.518g,
9.8ml,释至即得1000ml,醋酸-醋酸钠缓冲液取醋酸钠加水使溶解,用冰pH
4.
65.4g,50ml醋酸调节值至,再加水稀释至即得pH
4.6100ml,醋酸-醋酸钠缓冲液取醋酸钠加醋酸溶液pH
6.
054.6g,lmol/L20ml溶解后,加水稀释至即得500ml,。