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啤酒酵母选育紫外诱变及其突变株的性能测试材料与方法1材料
1.1种四铃啤酒酵母仪器分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸福装置、分析天平培养基麦芽汁培养基,麦芽汁固体培养基(麦芽汁由四铃啤酒厂提供)试验方法
1.2酵母菌的活化
1.
2.1取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养,于28c恒温培养箱培养14h,得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上,使用28c恒温培养14h,得到完全活化的正常生长的酵母菌
1.
2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定
1.
2.
2.1菌悬液的制备取10mL菌液离心收集菌体,洗涤2次后,菌体悬浮于10mL生理盐水中,制得菌悬液到人离心管注意总的溶液不要超出10毫升(既不要超出离心管再加少许5%TCA溶液研磨,倒上清液,重复3次最后一次将残渣一起的容量)
②离心,转速3000转/分钟,共三次第一次15分钟,取上清液后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中最后滤液保持18毫升左右
③水浴,在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀,在96c水浴锅中水浴2小时
④定容取样水浴后,用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀定容至25毫升的容量瓶中吸取
0.2ml的样品液,以蒸镭补至
2.0ml,然后加入6%苯酚L0ml及浓硫酸
5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度每次测定取双样参照以标准曲线计算多糖含量L
2.7不一致菌株产酒精能力(酒精度)测试快速氧化法乙醇在酸性条件下,通过量的、一定浓度的重倍酸钾作用,氧化生成醋酸再将剩余的的重倍酸钾经硫代硫酸钠还原由反应过程中,通过消耗的硫代硫酸钠的量计算酒精含量o试剂重倍酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液方法在蒸播器的接收瓶中,加入
10.00ml重倍酸钾溶液与25ml硝酸溶液并将空气冷凝器的出口插入此溶液中在蒸播瓶中加入12位水与
1.00ml试样接好装置,迅速加热至沸,并继续煮沸3分钟,蒸馈即告完成在同意瓶中,加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液,在电磁搅拌器搅拌下,用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点通过如下公式计算酒精含量式中V硫代硫酸钠标准溶液滴定量Vs试样取样量酒精%,V/V=
20.00-
0.6575V/Vs方法二
2.2蒸播一密度瓶法
2.
2.1仪器全玻璃蒸播器(500mL)、恒温水浴(精度±
0.1℃)、容量瓶(100mL)、移液管(100ml)分析天平(感量
0.hng)、天平(感量
0.1g)、25ml附温度计密度瓶
2.
2.2操作方法用100mL容量瓶准确量取试样100mL置于蒸储瓶中,用501nl水分三次冲洗容量瓶,洗液并入蒸储瓶中,加玻璃珠数粒,装上蛇型冷凝管,用原100nl1容量瓶接收储出液(外加冰浴),缓缓加热蒸馈,收集约961nl馈出液(蒸储应在30-60分钟内完成),取下容量瓶,调温到20℃,补水定容,混匀用25mL附温度计密度瓶测试样镭出液20℃的相对密度,根据相对密度查表,得到试样谯出液的酒精度(%,V/V),即为试样的酒精度
3.3蒸僧装置试剂重倍酸钾溶液、优级纯无水乙醇
2.4操作方法
2.
4.1标准曲线的制备吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中,稀释至刻度,混匀分别吸取此稀释液
0、
1、
2、
3、
4、
5、
6、7ml于50nli容量瓶中,各加
15.0ml重倍酸钾溶液,加水至刻度,混匀此标准系列相当于试样中含有
0.
0、
1.
00、
2.
00、
3.
00、
4.
00、
5.
00、
6.
00、
7.00V/V的酒精以空白标准作参比,在波长610nm,用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度用吸光度对酒精浓度作图,绘标准曲线
2.
4.2试样的测定在500ml蒸储烧瓶中,加入
100.0ml试样按L2方法进行蒸谯,最后加适量水将蒸储液补足为
100.0ml o吸取
1.0ml蒸谯液于50ml容量瓶中,按标准曲线的制备的操作测定其吸光度,由标准曲线查出酒精含量(%、V/V)o氨基氮含量的测定水合黄三酮是一种氧化剂,可使氨基酸脱竣氧化,而本身被还原成还原型水合萍三酮还原型水合年三酮再与末还原的水合黄三酮及氨反应,生成蓝紫色缩合物,颜色深浅与游离a-氨基氮含量成正比,可在570nm下比色测定
(1)样品稀释适当稀释样品至含卜3Uga-氨基氮/mL(麦汁通常稀释100倍,啤酒50倍,啤酒应先除气)
(2)测定取9支10mL比色管,其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液,另3支各吸入2mL试样稀释液,剩下3支吸入2mL蒸谓水然后各加显色剂1mL,分钟,分别加5mL碘酸钾稀释液,摇匀在30分钟内,以水样管为空白,在570nm盖玻塞,摇匀,在沸水浴中加热16分钟取出,在20℃冷水中冷却20波长下测各管的光密度计算a-氨基氮含量(Ug/mL)二(样品管平均O.D./标准管平均O.D.)X2义稀释倍数说明式中(样品管平均O.D./标准管平均O.D.)表示样品管与标准管之间的a-氨基氮之比;2标准管的a-氨基氮浓度(p g/mL),即(
0.1072X14/75)X100;方法二a-氨基氮的测定(苛三酮法)
1、实验试剂a显色剂100克磷酸氢二钠(NHP
04.1240)60克磷酸二氢钾(KH2P0J
5.00克水合荀三酮
3.00克果糖用水溶液溶解后稀释至1升(此溶液在低温下用棕色瓶可储存2周,pH应为操作时能够按比例配成100ml)b稀释溶液2克碘酸钾溶于600ml水中,再加入96%乙醇400mL c标准溶液溶
107.2mg甘氨酸于100ml水中,0℃贮藏用时按要求稀释该溶液含有200mga-氨基氮/升
2、实验操作取糖化的麦芽汁
1.00ml(或者者是其他的合适量,使稀释后的浓度为1-3mga-氨基氮/升),放入100ml的容量瓶中,稀释到刻度,摇匀标准甘氨酸溶液稀释液取
1.00ml标准溶液,在100ml的容量瓶中稀释到刻度取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液(三个)稀释液各
2.00ml,放入比色管中,(水用于空白参照),各比色管中分别加入
1.00ml的显色剂,摇匀,在沸水中加热16min(如今应该准备20℃的水浴)20℃水浴中冷却20min加入
5.00ml的碘酸钾稀释溶液,摇匀,在30min内于570nm处测定吸光度值
3、计算游离的a-氨基氮(毫克/升麦芽汁)=2X100X样品溶液吸光度值/标准溶液平均吸光度
1.
2.9絮凝性的测定良好的絮凝性不仅能够减少发酵液的澄清时间,降低酵母分离的能源消耗,还可防止酵母细胞长时间悬浮于发酵液中致使细胞自溶,有损啤酒风味方法取发酵度试验沉淀的酵母,通过洗涤与离心,称取L0g置于带刻度的锥形离心管内,使其悬浮在10mL pH
4.5的醋酸缓冲液(
0.51g硫酸钙,
6.8g冰醋酸用水稀释到1L)中,静置5min后,将此悬浮液重新连续摇动,使酵母重新全部悬浮起来,静置观察酵母凝聚沉降速度表2不一致菌株絮凝性的比较FB FB-E1FB-E2FB-E3FB-E4本斯值ml
3.
02.
83.
02.
83.2分别称取不一致菌株酵母在离心管中摇匀,静置沉降时,形成一清晰界面逐步下降酵母在沉降时形成一清晰界面,说明该酵母是凝集性酵母,从图2可见发酵度较高的菌株凝集性能稍差(做本试验时,室温若超过20C,这对酵母的凝集性可能稍有影响)
1.
2.10还原性糖的测定斐林试剂比色法测定还原糖(暂时不使用)
二、材料、仪器设备及试剂
1.分光光度计;
2.分析天平(感量1/10000);
3.水浴锅;
4.具塞刻度试管;
5.刻度吸管;
6.容量瓶;
7.离心机
1.斐林试剂A液40gCuS
04.5H20溶解于蒸储水定容至1L
2.斐林试剂B液200g酒石酸钾钠(KNaC4H4(k5上0)与150gNa0H溶于蒸储水中,并定容至1升A、B两液分别贮存,使用前等体积混合
3.
0.1%葡萄糖标准液取80℃下烘至恒重的葡萄糖
0.1000g,加蒸饵水溶解,定容至100mlo
4.
0.ImoL/LNaOHo
5.甲基红指示剂
0.1g甲基红溶于250mL60%乙醇中
6.10%Pb Aco
7.饱与Na2sO,20℃
19.5g2
三、实验步骤L标准曲线的制各管混合后加塞,于沸水浴中加热15min取出后自来水冷却,1500irm离心15min取上清液,用分光光度计在590nm波长下比色,以蒸谯水作参照,读取吸光度用空白管的吸光度与不一致浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标,对应的糖含量为纵坐标,绘制标准曲线
2.对含蛋白质较多的样品,此间可加10%Pb(Ac)2,除去蛋白质,至不再产生白色絮状沉淀时,加饱与Na2s04除去多余的铅离子
3.样品测定吸取61nl待测液,力(Umi斐林试剂,其它操作与标准曲线相同,在590nm波长下读取吸光度以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度,在标准曲线上查出糖含量.按下式计算还原糖的百分含量还原糖(%)=查得的糖毫克数X样品总体积X稀释倍数/(测定时取用体积X样品重X1000)X100方法2试剂与材料(暂时使用此方法)
1.斐林试剂甲
69.3C SO.5H O1000mL50mL/组乙346g酒石酸钾钠+100gNaOH1000mL50mL/U42组
2、1%次甲基蓝1g次甲基蓝+100mL水/班棕色瓶子储存
3、02%标准62gG105・度烘干到恒重加水到1000mL2000mL/班
4、碱式滴定管
5、样品溶液待测G液样品1稀释20倍,1000mL/班样品2稀释50倍,1000mL/班
6、电炉操作方法
1、斐林试剂标定A取甲液5mL+乙液5mL,(注意甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀,应将甲液加入乙液,使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶)置于250mL三角瓶中加入10mL水,并从滴定管加入02%的标准G若干毫升(约23mL)(量操纵在后滴定时消耗G在
0.5—
1.0mL)B电炉上加热至沸,并维持微沸2分钟,力口2滴1%次甲基溶液,趁沸以每两秒1滴的速度继续为滴加葡萄糖标准溶液用
0.2%标准G滴定至蓝色消失,有红棕色沉淀,溶液清亮为终点止记录耗用的G量V,务必在lmin内完成
2、定糖预备试验同1法取斐林试剂,加10mL样品液,摇匀于电炉上加热至沸腾,保持微沸2min,加2滴1%次甲基蓝,用
0.2%G滴定至蓝色消失记录耗用的G量为明
3、样品中还原糖测定同上法吸取斐林试剂加10mL样品液(预先稀释),补加(Vo-Vi)mL水,并从滴定管中预先加入(Vi-1)mL
0.2%G,摇匀至电炉上加热至沸,保持2min微沸,加入2滴1%次甲基蓝,继续用G滴定至蓝色消失记录消耗的标准G体积为V毫升
4、体积计算还原糖含量(以G计)(g/mL)=(Vo-V)*
0.002*l/10*nVo一一斐林试剂标定值,mLV--------样品糖液测定值,mL
0.002一一标准GS液浓度,g/mL10-------样品糖液体积,mLn——样品稀释倍数备注方案中几处指标使用多种方法,就是为了提高测量数据的准确率,同时比较检测方法的容易性、工作量、试剂的种类,以确定最终的方案取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中,摇匀,130r/min振荡培养,每隔2h取试管3个,放入冰箱,全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值,以空白的麦芽汁培养液为对比,根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线(此图视为参考)
1.
2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释,使菌种的浓度达到1x106个/近(此处菌悬液浓度的确定使用三种方法
1.显微镜直接计数法⑵平板菌落计数法;
3.光电比浊计数法)备注平板直接计数法假如过少菌液不易涂布开,过多则在涂布完后或者在培养时菌液仍会在平板表面流淌,不易形成单菌落,且培养周期长,耗时多,工作量大,但是也是我们的强项,能eq1酿酒酵母菌的生长曲线够锻炼大一的动手能力2显微镜直接计数法比较直观,我们能够直接显微观察,多人工作计数耗时较短,且工作量较小,同时我系其他实验组使用此方法计数,可供参考3光电比浊法尽管绘制标准曲线要求较高,但是工作量较小,且一次绘制好标准曲线好后,以后能够用,准确率较高比较三种方法,我倾向于第一种与第三种,二者相比较,能够校正方案实验步骤:打开30W紫外灯预热30min,使其功率达到稳固1取斜面菌苔一环于20mL麦汁中混匀,28℃活化培养14ho2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min,弃上清液加入4mL生理盐水洗涤,在电磁振荡仪上震荡lOmin左右,重复2次,制成5mL悬液,用血球计数板在显微镜下直接计数,调整细胞浓度3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释,分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板,约为10弋up、10工每一个梯度3个平板,每一个平板加
0.2mL菌液,进行培养后平板计数法,作为参照4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中,加入一无菌磁力转子,置于磁力搅拌器上530W紫外灯下30cm处照射,调整照射时间本次预设为0,30,45,60,90,120,180,
600.(单位s)6取一定稀释梯度的紫外照射菌液
0.1(视具体情况而定)用无菌涂布棒涂布均匀,每组做三个平行线培养记录菌落数,计算各照射时间下的致死率(选在75%-80%o致死率二未经照射菌落数-紫外照射菌落数未经紫外照射菌落数7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养,然后重复1-5,再重复第5步,挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养,连续进行次,28℃培养20h左右,计算其突变率与致死率(上述时间等数字视为参考数值)诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好,落呈中等大小、乳白
1.
2.
3.1初筛色、表面光滑与边缘整齐的菌落移接斜面供复筛
1.
2.
3.2复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵,测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能双乙酰含量测定:初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml12°Bx麦芽汁发酵8d后,测定发酵液中的双乙酰含量,选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵,将双乙酰含量明显降低的4株菌分别编号为FB-E
1、FB-E
2、FB-E3与FB-E4o结果见表1表1发酵液中双乙酰含量的比较F BFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4双乙酰含量mg/L
0.
12330.
07060.
09260.
07760.0870降低率(%)
042.
724.
937.
129.4(此处绘制表格样式视为参考)双乙酰代谢的操纵:1,降低前驱物质a-乙酰乳酸的生产量措施改良酵母菌种提高麦汁中a-氨基氮含量,能够抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原措施提高酵母的细胞密度(增大酵母菌的接种量)提高还原温度(封罐后高温还原)限制后期酵母的出芽率(封罐)标中关于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒
0.2mg/L一级啤酒:
0.13mg/L方法:标GB4927-2001检测培养条件恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量原理双乙酰的测定方法使用比色法邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法,因此,此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量,结果偏高但此法快速简便用蒸汽将双乙酰从样品中蒸储出来,加邻苯二胺,形成2,3一二甲基唾喔琳,其盐酸盐在335nm波长下有一最大汲取峰,可进行定量测定1仪器带有加热套管的双乙酰蒸储器,蒸汽发生瓶2000mL或者3000mL或者者锥形瓶,平底烧瓶,容量瓶25mL2试剂与溶液盐酸溶液4moL/L,邻苯二核溶液10g/L称取邻苯二钱
0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀,放于阴暗处,注意此溶液即用即配消泡剂3实验步骤1把双乙酰蒸播器安装好,把夹套蒸储器下端的排气夹子打开2将内装
2.5mL蒸储水的容量瓶或者量筒放于冷凝器下,使出口尖端浸没在水面下,外加冰水冷却3加热蒸汽发生器至沸,通汽加热夹套,备用4于100mL量筒中加入24滴消泡剂,再注入5℃左右未除气啤酒100mL5待夹套蒸储器下端冒大汽时,打开进样口瓶塞,将啤酒迅速注入蒸储器内,再用约10mL蒸馈水冲洗量筒,同时倒入,迅速盖好进样口塞子,用水封口6待夹套蒸储器下端再次冒大汽时,将排气夹子夹住,开始蒸储,到储出液接近25mL时取下容量瓶,用水定容至25mL,摇匀蒸储应在3分钟内完成7分别吸取储出液10mL于两支比色管中一管作为样品管加入
0.5mL邻苯二胺溶液,另一管不加作空白,充分摇匀后,同时置于暗处放置20-30分钟,然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液,于空白管中加
2.5mL4N盐酸溶掖,混匀8在335nm波长处,用1cm比色皿以空白作参照测定样品吸光度9计算双乙酰叱/1=人335义
2.4用2011111石英比色皿时,吸光度与双乙酰的换算系数注若用20mm的石英比色皿则换算系数则为
1.2L
2.4不一致菌株的发酵性能测试CO2失重法将发酵摇瓶置于26度恒温环境中,每天称重1次直至日失重小于
0.5g为止,因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同,因此只需计算发酵后单位时间内CO的释放量,发酵6d,以CO2产生量为纵坐标,发酵时间为横坐标,绘制CO2产生量曲线L
2.6不一致菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定从8个发酵后的发酵瓶中各取o.2mL发酵液并稀释500倍,用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量附录硫酸-苯酚法1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg,蒸馈水准确定容500mL得到
0.04mg/L的葡萄糖液2)试剂1)浓硫酸分析纯,
95.5%2)80%苯酚80克苯酚(分析纯重蒸镭试剂)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存3)6%苯酚临用前以80%苯酚配制(每次测定均需现配)4)15%三氯乙酸(15%TCA)15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存5)5%三氯乙酸(5%TCA)25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存6)6mol/L氢氧化钠120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水7)61nol/L盐酸表1标准曲线的制作步骤管号012345678葡萄糖
0.
00.
40.
60.
81.
01.
21.4L
61.8蒸馆水
2.
01.
61.
41.
21.
00.
80.
60.
40.2苯酚液
1.
01.0L
01.
01.
01.
01.
01.
01.0浓硫酸
5.
05.
05.
05.
05.
05.
05.
05.
05.0取8支干净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大汲取波长处测定吸光度以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标,从而来绘制标准曲线
1.制作标准曲线准确称取标准葡聚糖(或者葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取
0.
4、
0.
6、
0.
8、
1.
0、
1.
2、
1.
4、
1.
6、
1.8,各以蒸饵水补至
2.0ml,然后加入6%苯酚
1.0ml及浓硫酸
5.0ml,摇匀冷却,室温放置20分钟以后于490nm测光密度,以
2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线
2.样品含量测定
①取样品1克(湿样)力口lmL15%TCA(三氯醋酸)溶液研磨,再加少许5%TCA溶液研磨,倒上清液于10毫升离心管中,。